东北红豆杉素在作为鉴别东北红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用制造技术

本发明专利技术公开一种东北红豆杉素在作为鉴别东北红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用。利用色谱结合UPLC

【技术实现步骤摘要】
东北红豆杉素在作为鉴别东北红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种东北红豆杉素在作为鉴别东北红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用。

技术介绍

[0002]红豆杉为红豆杉科红豆杉属乔本植物，原产于喜马拉雅和亚洲东南部部分地区。作为药用植物，红豆杉是远古第四纪冰川时期遗留下来的56种濒危物种植物中，最为珍稀的一种。目前，中国已将其列入国家一级珍稀濒危植物保护范围。红豆杉属植物在全世界有至少15种，我国有4种加一个变种。红豆杉可适应的生长环境较广，包括山地、温带、暖温带和热带的山麓，以及高山、山地、森林，如落叶林、常绿林或混合林等。于全球范围内，红豆杉的海拔分布大致在900～3700m这一区间。
[0003]中国红豆杉含有紫杉醇。据统计的临床实验结果表明，紫杉醇对多种癌症亦有显著疗效，总有效率达75％以上，主要用于治疗晚期乳腺癌、肺癌、卵巢癌及头颈部癌、软组织癌和消化道癌，被称为“抗癌明星”。截至目前，已有多个国家获准紫杉醇用于临床治疗。近来还研究发现紫杉醇对类风湿性关节炎、老年性痴呆症等都有很好的疗效。中国红豆杉树形美观大方，四季常青，果实成熟期红绿相映的颜色搭配令人陶醉，可广泛应用于水土保持、园艺观赏等方面，是新世纪改善生态环境，建设秀美山川的优良树种，现常用于高档的庭院绿化观赏。因此，在我国的广大山区都有引种和栽培。
[0004]东北红豆杉(Taxus cuspidata)是红豆杉科，红豆杉属乔木，高可达20米，胸径最大可达1米，树皮红褐色，有浅裂纹。东北红豆杉分布于中国吉林老爷岭、张广才岭及长白山区，日本、朝鲜、俄罗斯也有分布，是一种濒危珍稀野生植物。东北红豆杉是红豆杉科红豆杉属的一种世界公认的珍稀濒危植物，具有极高的药用价值。目前，针对东北红豆杉形态、代谢和生长发育的研究已经取得了初步的进展，但其雌雄幼苗在形态学上高度相似，这给两者的区分鉴别工作带来了一定的困难。为推广高效主栽品种、大规模进行有效成分生产以及可持续地开展野生红豆杉资源保护，对东北红豆杉雌雄幼苗准确、快速的鉴别与区分，是亟待奠定的前提条件。
[0005]非靶向代谢组学(Untargeted metabolomics)是指采用LC
‑
MS、GC
‑
MS、NMR等技术，无偏向性地检测细胞、组织、器官或者生物体内受到干扰前后的全部内源性小分子代谢物的动态变化，并通过大数据筛选出差异代谢物，对差异代谢物进行相关通路分析，揭示产生这一系列变化的分子生物学机制。再收集代谢物的核质比信号，分析代谢谱，从而预测一条特定的代谢途径，以发现具有特征指示作用的代谢物。目前，通过代谢组技术来发现不同生物样本间的代谢标志物，已成为当前的一个研究热点。但在植物学及相关领域，利用该技术筛选代谢标志物并用于木本植物雌雄鉴定的研究鲜有报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在针对现有技术的缺陷，提供东北红豆杉素在作为鉴别东北红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用，东北红豆杉素在东北红豆杉雄株幼苗中的含量远高于雌株幼苗，这一技术手段的提出，较好地解决了红豆杉人工育种和造林过程中遇到的树种鉴定等相关问题。
[0007]东北红豆杉素在作为鉴别东北红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用，东北红豆杉素的化学特征主要为：其分子式为C
44
H
48
O
15
，分子量为816.85，化学结构式如下所示：
[0008][0009]作为优选，东北红豆杉雄株幼苗中东北红豆杉素的质量含量是雌株幼苗中的4
‑
6倍。
[0010]本专利技术的另一目的是提供东北红豆杉雌雄株的检测方法，具体为：
[0011]1)东北红豆杉雌雄株枝条样品研磨后，使用体积含量45％
‑
55％的甲醇溶液提取样品的代谢物；具体是：
[0012]将120μL体积含量为50％的甲醇溶液预冷至
‑
20℃，之后加入25mg研磨后东北红豆杉样品中，轻微震荡1min，室温下孵育10min，再置于
‑
20℃下，过夜，4000
×
g离心20min后，将上清液于
‑
80℃保存或干燥保存；
[0013]2)对上述提取液上清液进行LC
‑
MS分析，通过东北红豆杉素的质量含量进行判断，若东北红豆杉素的质量含量高于0.2mg/g则为东北红豆杉雄株幼苗，低于0.006mg/g则为东北红豆杉雌株幼苗；
[0014]高效气相色谱条件如下：
[0015]色相系统为：SCIEX UPLC系统；
[0016]色谱柱温度为：35℃；
[0017]色谱柱为：安捷伦酸性丙烯酰胺柱(100mm
×
2.1mm，1.7μm,Waters，UK)；
[0018]流动相：流动相A为25mM醋酸铵+25mM氨水，流动相B为体积比为9:1的IPA和CAN混合液+体积含量为0.1％的蚁酸；
[0019]流动相梯度为：0
‑
0.5min为体积含量95％的流动相B、0.5
‑
9.5min为体积含量95％
‑
65％的流动相B、9.5
‑
10.5min为体积含量65％
‑
40％的流动相B、10.5
‑
12min为体积含量40％
‑
95％的流动相B、12.2
‑
15min为体积含量95％的流动相B；
[0020]质谱条件如下：
[0021]高分辨率质谱仪：TripleTOF5600plus型；
[0022]遮蔽气设置为30PSI，离子源Gas1为60PSI，离子源Gas2为60PSI；
[0023]加热温度为650℃；
[0024]对于正离子模式，离子喷射电压分别为5000V，对于负离子模式，离子喷雾电压浮动分别为
‑
4500V；
[0025]质谱数据采集采用IDA模式，TOF质量范围为60
‑
1200Da。
[0026]本专利技术的又一个目的是提供东北红豆杉素在鉴定东北红豆杉雌雄幼苗的试剂盒中的应用。
[0027]本专利技术能产生的有益效果：
[0028]1.本专利技术最终筛选得到一个区分不同性别东北红豆杉的代谢物标志物，并提供了相应的检测方法。本专利技术通过分析东北红豆杉雌雄株幼苗的代谢谱，鉴定代谢物的化学成分，成功筛选出存在显著差异的积累代谢物，从而得到了用于区分东北红豆杉雌雄株幼苗的代谢物标志物。
[0029]2.本专利技术鉴别方法精确度高，操作程序化，灵敏度高，结果准确可靠。
[0030]3.本专利技术可直接用于野外采集的样本，无需预先冷冻保存，采集得到的样本仅需在室温下简单干燥保存，即可用于代谢标志物的提取和检测。同时，本专利技术所需的检测样本生物量较少，仅为25mg，最大程度地减少了对需鉴定的珍本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.东北红豆杉素在作为鉴别东北红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用，其特征在于所述东北红豆杉素的分子式为C
44
H
48
O
15
，分子量为816.85，其化学结构式如下所示：2.一种区分东北红豆杉雌雄株的检测方法，其特征在于所述方法具体是：1)将东北红豆杉雌雄株枝条经研磨后，使用甲醇溶液提取代谢物；2)对上述提取液上清液进行LC
‑
MS分析，判断东北红豆杉素的质量含量是否高于1.32mg/g，若是则为东北红豆杉雄株幼苗，若否则为东北红豆杉雌株幼苗；所述东北红豆杉素的分子式为C
44
H
48
O
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，分子量为816.85，其化学结构式如下所示：3.如权利要求2所述方法，其特征在于步骤1)提取代谢物过程具体是：将120μL体积含量为45％
‑
55％的甲醇溶液预冷至
‑
20℃后，加入至25mg研磨后东北红豆杉样品中，震荡1min，室温下孵育10min，再次置于
‑
20℃下，过夜，4000
×
g离心20min后，取上清液并于
‑
80℃保存或干燥环境下保存。4.如权利要求2所述方法，其特征在于所述东北红豆杉雌雄株均为幼苗。5.如权利要求2所述方法，其特征在于所述LC
‑
MS分析参数包括：高效气相色谱条件如下所示：色相系统...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈晨佳，侯凯琳，张洪山，梁雪霜，冯尚国，王慧中，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：