一种立体选择性羧酯酶、编码基因、载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种立体选择性羧酯酶、编码基因、载体及其应用。本发明专利技术的立体选择性羧酯酶对多种环烷烃甲酯类底物具有较高的活力，利用本发明专利技术所述的羧酯酶催化动力学拆分环烷烃甲酯类底物时，反应条件温和，操作过程简便，易于放大；通过该动力学拆分反应制备所得的手性酸产物浓度高，光学纯度高，ee值可达99％，具有良好的工业应用前景。良好的工业应用前景。良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种立体选择性羧酯酶、编码基因、载体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种立体选择性羧酯酶、编码基因、载体及其应用，属于生物工程


技术介绍

[0002](S)
‑
氧杂环己烷
‑2‑
甲酸((S)
‑
THPCA)是一种重要的手性化工原料和医药中间体，广泛的应用于手性合成领域，特别是在手性药物制备方面，也是药物的重要手性构建块，如针对II型糖尿病的Danuglipron(PF
‑
06882961)，其需求量在飞速的增长。由于氧杂环己烷
‑2‑
甲酸酯连接到手性中心的两个取代基差异很小，很少有报道的酶具有对映体选择性来区分杂环羧酸酯的两个对映体。此外，使用手性助剂的杂环羧酸酯的化学拆分也具有挑战性，这也是因为其特殊的对称结构。因此鉴定具有高对映体选择性的新型羧酸酯酶，对高效合成手性氧杂环羧酸及其衍生物，阐明羧酸酯酶对映体选择性的分子机理具有重要意义。
[0003]用于生物法制备(S)
‑
THPCA的生物催化剂既可以是整细胞，也可以是酶。因为细胞内含有多种酶，整细胞催化往往会遇到副反应的问题，副反应的存在会降低目标反应产物的得率。对于拆分氧杂环己烷
‑2‑
甲酸酯这种一步反应来说，酶法催化更具优势，既可以彻底避免副反应的问题，也可以克服细胞膜阻碍底物和产物跨膜传递的问题。因而，通过基因工程技术高产酯酶，将为其在氧杂环己烷
‑2‑
甲酸酯中的应用奠定良好的基础。
[0004]羧酯酶(Carboxylesterases，EC 3.1.1.1)是一类催化酯键(羧酯键、酰胺键、硫酯键等)水解和合成的酶。工业应用的羧酯酶多数来自微生物，这类微生物从分类上看主要是真菌，主要包括黑曲霉、链孢霉、青霉、黄曲霉、毛霉、犁头菌、红曲霉、根霉、白地霉、核盘菌、酵母菌和须霉等12属23种；其次是细菌，包括伯克霍尔德属、葡萄球菌属、假单胞菌属及芽孢杆菌属等。这些野生菌中羧酯酶含量较低并且比较杂，利用其作为生物催化剂进行大规模的工业化生产存在一定的难度，因而构建羧酯酶基因工程菌从而大量生产重组羧酯酶具有十分重要意义。因此针对氧杂环己烷
‑2‑
甲酸酯化合物，亟需筛选高效和高选择性的生物催化剂，以满足工业需要。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术针对现有的生物催化动力学拆分氧杂环己烷
‑2‑
甲酸酯制备(S)
‑
THPCA的反应中，可提供该反应的羧酯酶报道较少的问题，提供一种具有优异的不对称催化活性、立体选择性好的羧酯酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及重组酶和该重组酶的制备方法，以及该羧酯酶或其突变重组酶的应用。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种立体选择性羧酯酶，所述的立体选择性羧酯酶是如下(a)或(b)的羧酯酶：
[0007](a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的羧酯酶；
[0008](b)由(a)中所述羧酯酶经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的具有羧酯酶活性的衍生蛋白质。
[0009]SEQ ID NO.2的序列具体如下：
[0010]MAIRETVGVDGTPLVYSVTGDPDARALVLLHGWAQSSKCWGPGVLDELAARYRVIAVDLRGHGYSGAPDTGYDDSAVWAGDVDAVLTAEGVTSGAVLLGWSYGGLVICDYLASNGTSAVDGVVLVGAITSIGRGEAGGKVGAAMRAAIPGAMSEEPREAIRALGAFGNALTGPPEGKGAQSQALFGASLTTPPRVRAALFNRSASHDDLLRSLDVPVLVLHGTEDSVVDVSAGRHAAELIPQARASFWEGCDHGPFVEDPERFVKEVGEFVDNLG。
[0011]进一步地，所述的衍生蛋白质是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的羧酯酶的第144位甲硫氨酸突变为苏氨酸，第148位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第149位脯氨酸突变为丙氨酸，该突变体(M144T/I148F/P149A)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]SEQ ID NO.4的序列具体如下：
[0013]MAIRETVGVDGTPLVYSVTGDPDARALVLLHGWAQSSKCWGPGVLDELAARYRVIAVDLRGHGYSGAPDTGYDDSAVWAGDVDAVLTAEGVTSGAVLLGWSYGGLVICDYLASNGTSAVDGVVLVGAITSIGRGEAGGKVGAATRAAFAGAMSEEPREAIRALGAFGNALTGPPEGKGAQSQALFGASLTTPPRVRAALFNRSASHDDLLRSLDVPVLVLHGTEDSVVDVSAGRHAAELIPQARASFWEGCDHGPFVEDPERFVKEVGEFVDNLG。
[0014]本专利技术所述羧酯酶的来源较佳地包括：提取自然界中天然存在的羧酯酶，通过人工合成氨基酸全序列所得的羧酯酶，通过基因工程方法克隆表达所得的羧酯酶。
[0015]本专利技术所述羧酯酶较佳地来源于红球菌属。所述羧酯酶通过基因组挖掘的方法获得，通过测定比较水解酶的活力及其对外消旋氧杂环己烷
‑2‑
甲酸酯的立体选择性等，对所克隆的酶进行反复比较和筛选，最终获得催化性能最佳的羧酯酶，即来自红球菌Rhodococcus opacus的羧酯酶RoCE(Genbank登录号：ANS30253.1)，测所述羧酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0016]本专利技术所述羧酯酶的基因来源包括：通过基因克隆技术获得羧酯酶基因，或者通过人工全基因合成的方法得到所述羧酯酶基因。本专利技术所述羧酯酶基因来源较佳地为：红球菌(Rhodococcus opacus)。其具体制备方法较佳地包括：根据Genbank中收录的预测为水解酶的红球菌(Rhodococcus opacus)基因(Genebank登录号：CP009111.1)序列设计合成引物，所述引物优选地为：
[0017]上游引物：5'
‑
gtgccgcgcggcagccatatgATGGCAATTCGTGAGACCGT
‑
3'
[0018]下游引物：5'
‑
acggagctcgaattcggatccTTAACCCAGATTGTCCACGAATT
‑
3'
[0019]其中，上游引物核苷酸序列下划线部分为NdeI酶切位点，下游引物下划线部分为BamHI酶切位点。然后以Rhodococcus opacus菌的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得完整的羧酯酶全长基因DNA片段。其中所述羧酯酶全长基因(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示)，命名RoCE，全长为828个核苷酸碱基。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种立体选择性羧酯酶，其特征在于，所述立体选择性羧酯酶是如下(a)或(b)的羧酯酶：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的羧酯酶；(b)由(a)中所述羧酯酶经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸得到的具有羧酯酶活性的衍生蛋白质。2.根据权利要求1所述的立体选择性羧酯酶，其特征在于：所述的衍生蛋白质是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的羧酯酶的第144位甲硫氨酸突变为苏氨酸，第148位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第149位脯氨酸突变为丙氨酸。3.编码权利要求1或2所述的立体选择性羧酯酶的基因。4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。5.携带权利要求3或4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国超，窦哲，倪晔，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：