一种竞争型中华鲟促卵泡生成素检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种竞争型中华鲟促卵泡生成素检测试剂盒及应用，属于生物检测技术领域。该试剂盒包括中华鲟FSH抗体、中华鲟FSH蛋白标准品和FSH示踪剂；中华鲟FSH抗体为中华鲟重组FSHβ蛋白经动物免疫后获得的多克隆抗血清纯化制得；中华鲟FSH蛋白标准品为中华鲟重组FSHβ蛋白；FSH示踪剂为中华鲟重组FSHβ蛋白经生物素标记制得。采用本发明专利技术提供的试剂盒进行中华鲟血清、垂体裂解液或培养液等样品中的FSH检测具有较高的灵敏度和特异性，并且方法简单、高效且成本低，所得检测数据稳定、准确。确。确。

【技术实现步骤摘要】
一种竞争型中华鲟促卵泡生成素检测试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种竞争型中华鲟促卵泡生成素检测试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]中华鲟是地球上最古老的脊椎动物，其形态威猛，个体硕大，寿命较长，是淡水鱼类中个体最大、寿命最长的鱼。中华鲟性成熟周期时间长，其中雄鱼性成熟时间为九年以上，雌鱼性成熟时间为十四年以上。与哺乳动物类似，鱼类性成熟启动和生殖能力的获得受“下丘脑
‑
垂体
‑
性腺(HPG)”轴的控制，其中垂体分泌的促卵泡生成素(FSH)是调控鱼类性腺发育和繁殖的关键的激素。通常当鱼类处于排卵期时，其血液中的FSH会达到一个高峰，因此对鱼类体内FSH的定量检测常被用来判断鱼类的排卵情况。
[0003]中华鲟促卵泡生成素(FSH)是二聚体结构，由α和β两个亚基以非共价键相连接组成，单独的每个亚基只能保留整个激素分子生物活性的一小部分，只有两个亚基结合在一起才能发挥激素的生物学活性。FSHβ亚基是FSH唯一的特异性亚基，由128个氨基酸组成的蛋白，约14kd，具有活性的二聚体FSH约23kd。由于种属差异的原因，目前没有特异性定量检测中华鲟FSH的试剂盒。现在对中华鲟FSH的检测通常采用Western blot方法，然而该方法操作繁琐、耗时长且通量小。此外，也有利用其它鱼类FSH抗体制备的放射免疫分析和酶免疫分析试剂盒，但放射免疫分析会造成放射性污染，且试剂盒保存时间短。酶联免疫分析为定性或半定量方法，并且由于未采用中华鲟FSH抗体，因此特异性效果也很不理想。
[0004]因此，如何提供一种竞争型中华鲟促卵泡生成素检测试剂盒及应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术根据荧光免疫检测技术提供了一种竞争型中华鲟促卵泡生成素检测试剂盒。荧光免疫检测技术具有专一性强、灵敏度高、实用性好等优点，作为免疫分析法的一种，竞争型(以标记抗原的竞争型为例)的测定原理是基于未标记的抗原和标记抗原竞争结合有限的抗体而实现的免疫分析法。检测时，抗体和标记抗原的浓度是固定的。当未标记的抗原加到抗体和标记抗原的免疫混合物中后，抗原和抗体的结合使得标记抗原与抗体的免疫复合物的量减少。样品中存在的抗原越多，抗体结合的标记抗原便越少，从抗体
‑
标记抗原免疫复合物的减少或游离标记抗原的增加，可以定量测定出样品中待测抗原的含量。用已知浓度的样品制备标准曲线，未知浓度的样品则可通过与标准曲线比较得出分析结果。采用本专利技术提供的试剂盒进行中华鲟血清或或垂体裂解液等样品中的FSH检测具有较高的灵敏度和特异性，并且方法简单、高效且成本低，所得检测数据稳定、准确。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种竞争型中华鲟促卵泡生成素检测试剂盒，包括中华鲟FSH抗体、中华鲟FSH蛋白标准品和FSH示踪剂；
[0008]中华鲟FSH抗体为中华鲟重组FSHβ蛋白经动物免疫后获得的多克隆抗血清纯化制得；
[0009]中华鲟FSH蛋白标准品为中华鲟重组FSHβ蛋白；
[0010]FSH示踪剂为中华鲟重组FSHβ蛋白经生物素标记制得；
[0011]中华鲟重组FSHβ蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3:所示：
[0012]MASVLFCFVLLCWAAGQCHASCALENITIGIEKDGCGNCVSVNTTSCAGRCLTQADVYKSSISLYTQLVCTFKEISYVTVQLPNCPEHVDPFYTYPVALSCECGQCATDYTDCGTLSLGPSDCFSQED。
[0013]进一步优选地，编码上述中华鲟重组FSHβ蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4:所示：
[0014]ATGGCATCAGTTCTGTTTTGCTTTGTGTTGCTGTGCTGGGCAGCTGGGCAGTGTCATGCCAGCTGTGCCCTGGAGAACATCACGATAGGGATAGAGAAAGACGGCTGCGGGAACTGTGTGTCTGTCAACACCACCTCCTGTGCCGGGAGGTGCCTTACGCAGGCCGATGTGTACAAGAGCTCAATATCACTCTACACCCAGCTGGTTTGCACCTTTAAAGAGATCTCCTATGTAACAGTGCAGCTGCCCAACTGCCCCGAACACGTGGATCCTTTTTACACCTACCCCGTGGCGCTCAGCTGTGAGTGTGGCCAGTGTGCCACGGACTACACTGACTGTGGCACCCTAAGCCTTGGACCCTCCGACTGCTTCAGCCAGGAGGACTAG。
[0015]优选地，中华鲟重组FSHβ蛋白的制备方法为：
[0016](1)提取中华鲟垂体mRNA，反转录为cDNA，PCR扩增FSHβ亚基ORF区序列，双酶切得FSHβ双酶切产物；
[0017](2)双酶切表达载体pET
‑
28a+；
[0018](3)将FSHβ双酶切产物与双酶切后的pET
‑
28a+表达载体进行连接，得原核表达重组质粒pET
‑
28a+
‑
FSHβ；
[0019](4)将原核表达重组质粒pET
‑
28a+
‑
FSHβ转化BL21感受态细胞，经诱导表达、纯化获得中华鲟重组FSHβ蛋白。
[0020]优选地，步骤(1)中，
[0021]PCR上游引物：5
’‑
CCGGAATTCATGGCATCAGTTCTGTTTTGCTTT
‑3’
，如SEQ ID NO.1所示；
[0022]PCR下游引物：5
’‑
CCGCTCGAGCTAGTCCTCCTGGCTGAAGCAGTC
‑3’
，如SEQ ID NO.2所示；
[0023]PCR反应程序：
[0024]94℃预变性5min；
[0025]94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，38个循环；
[0026]72℃延伸5min；
[0027]步骤(2)(3)中，
[0028]双酶切使用限制性内切酶EcoR I和Xho I；
[0029]步骤(4)中，
[0030]诱导表达条件为：28℃，0.5mM IPTG终浓度诱导表达8h。
[0031]优选地，中华鲟FSH抗体的制备方法：
[0032]1)将纯化的中华鲟重组FSHβ蛋白用PBS稀释，再与弗氏佐剂混匀乳化，对家兔进行免疫，免疫完毕后，得兔抗FSHβ多克隆抗血清；
[0033]2)利用蛋白A/G纯化法对兔抗FSHβ多克隆抗血清进行纯化获得中华鲟FSH抗体；
[0034]中华鲟FSH抗体储存浓度为2mg/mL。
[0035]优选地，中华鲟FSH蛋白标准品使用时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种竞争型中华鲟促卵泡生成素检测试剂盒，其特征在于，包括中华鲟促卵泡生成素抗体、中华鲟FSH蛋白标准品和FSH示踪剂；所述中华鲟FSH抗体为中华鲟重组FSHβ蛋白经动物免疫后获得的多克隆抗血清纯化制得；所述中华鲟FSH蛋白标准品为中华鲟重组FSHβ蛋白；所述FSH示踪剂为中华鲟重组FSHβ蛋白经生物素标记制得；所述中华鲟重组FSHβ蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3:所示：MASVLFCFVLLCWAAGQCHASCALENITIGIEKDGCGNCVSVNTTSCAG RCLTQADVYKSSISLYTQLVCTFKEISYVTVQLPNCPEHVDPFYTYPVALSCEC GQCATDYTDCGTLSLGPSDCFSQED。2.根据权利要求1所述的一种竞争型中华鲟促卵泡生成素检测试剂盒，其特征在于，所述中华鲟重组FSHβ蛋白的制备方法为：(1)提取中华鲟垂体mRNA，反转录为cDNA，PCR扩增FSHβ亚基ORF区序列，双酶切得FSHβ双酶切产物；(2)双酶切表达载体pET
‑
28a+；(3)将FSHβ双酶切产物与双酶切后的pET
‑
28a+表达载体进行连接，得原核表达重组质粒pET
‑
28a+
‑
FSHβ；(4)将原核表达重组质粒pET
‑
28a+
‑
FSHβ转化BL21感受态细胞，经诱导表达、纯化获得中华鲟重组FSHβ蛋白。3.根据权利要求2所述的一种竞争型中华鲟促卵泡生成素检测试剂盒，其特征在于，步骤(1)中，PCR上游引物：5
’‑
CCGGAATTCATGGCATCAGTTCTGTTTTGCTTT
‑3’
，如SEQ ID NO.1所示；PCR下游引物：5
’‑
CCGCTCGAGCTAGTCCTCCTGGCTGAAGCAGTC
‑3’
，如SEQ ID NO.2所示；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，38个循环；72℃延伸5min；步骤(2)(3)中，所述双酶切使用限制性内切酶EcoR I和Xho I；步骤(4)中，所述诱导表达条件为：28℃，0.5mM IPTG终浓度诱导表达8h。4.根据权利要求1所述的一种竞争型中华鲟促卵泡生成素检测试剂盒，其特征在于，所述中华鲟FSH抗体的制备方法：1)将纯化的中华鲟重组FSHβ蛋白用PBS稀释，再与弗氏佐剂混匀乳化，对家兔进行免疫，免疫完毕后，得兔抗FSHβ多克隆抗血清；2)利用蛋白A/G纯化法对兔抗FSHβ多克隆抗血清进行纯化获得中华鲟FSH抗体；所述中华鲟FSH抗体储存浓度为2mg/mL。5.根据权利要求1所述的一种竞争型中华鲟促卵泡生成素检测试剂盒，其特征在于，所述中华鲟FSH蛋白标准品使用时的浓度为500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：呼光富，王丽，刘香江，史雪涛，欧阳雨，谢云轶，肖衎，舒婷婷，杨菁，杜合军，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：