一种基因检测分子及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于RNaseHII核酸酶独特切割作用的分子信标、包含该分子信标的检测组合物、以及利用该分子信标进行基因检测的方法。利用热稳定性RNaseHII核酸酶，本发明专利技术提供的基因检测方法能够在较高的温度条件下，实现对目标核酸序列的检测。本发明专利技术提供的检测方法能够很好地抑制由非特异杂交产生的背景信号，提高检测的特异性和灵敏度。提高检测的特异性和灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种基因检测分子及应用


[0001]本专利技术属于核酸检测领域，具体涉及一种核酸分子信标及其应用。

技术介绍

[0002]在基础研究以及临床实践中，核酸检测具有广泛的应用，尤其在病原体检测中发挥了重要的作用。聚合酶链式扩增(PCR)是目前主流的病原体核酸检测技术，具有极高的检测特异性和灵敏度。但由于PCR方案对检测环境、设备、人员的要求较高，其在临床上的应用也受到了一定程度的限制。
[0003]分子信标(Molecular beacon)是另一项具有临床应用潜力的核酸检测技术，是以碱基互补配对原则、荧光共振能量转移原理为基础独立发展起来的一项核酸检测技术。分子信标是一个能形成“茎环结构”的单链寡聚核苷酸分子，长度一般为25
‑
35个核苷酸，其一端被荧光基团标记，另一端被荧光淬灭基团标记。分子信标的5
’
端、3
’
端邻近核酸序列互补，能形成双链的“茎状区域”，使荧光基团和淬灭基团相互靠近。基于荧光共振能量转移原理，荧光基团发出的荧光几乎完全被淬灭基团吸收，并以热的形式散发出去，这使得以“茎环结构”形态存在的分子信标的荧光本底值极低。当“茎环结构”被破坏后，荧光基团与淬灭基团分离，不再发生荧光能量共振转移现象，使得荧光信号的检测值升高，且荧光信号的强度与被破坏的“茎环结构”的量成正比。
[0004]自分子信标技术建立以来，在实时定量PCR、基因突变分析、病原体检测等多个方面得到了应用。理想状态下，该技术的检测特异性依赖于信标分子的“环状区域”序列与被检测核酸靶序列之间形成的具有严格碱基互补配对的杂交双链。但在实际检测中，由于被检测样本的复杂性，分子信标的杂交不仅发生在“环状区域”与被检测的核酸靶序列之间，也会发生在“茎状”区域序列与非靶序列之间。此外，由于检测温度较低，非特异性杂交也会导致背景信号增强。
[0005]就分子信标的实际应用情况来看，由于序列、反应条件等因素导致的非特异性杂交，是影响检测特异性的核心问题，也是后续技术发展中需要克服的障碍。

技术实现思路

[0006]针对分子信标技术中的问题，本专利技术提供了一种新颖的解决方案。利用RNase H2核酸酶独特的切割作用，在较高的温度条件下实现对目标核酸序列的特异性检测。
[0007]RNase H2核酸酶是逆转录病毒整合酶超家族的一个成员，参与基因组序列的切除修复过程。该核酸酶保守地存在于真核、以及原核细胞中，能够识别DNA双链中出现的单个核糖核苷酸掺入，并在核糖核苷酸的5
’
端进行切割。
[0008]在本专利技术提供的分子信标“环状区域”的靶序列识别区中，存在一个核糖核苷酸，其他的核苷酸为脱氧核糖核苷酸。当分子信标的靶序列识别区与被检测核酸分子的靶序列之间形成杂交双链后，PaRNase H2蛋白能够识别、结合这种双链结构，并在分子信标的核糖核苷酸位点的5
’
端进行切割。切割作用会破坏分子信标原有的“茎环结构”，使荧光基团与
淬灭基团分离，这样就能检测到荧光基团发出的荧光信号，从而实现对目标核酸序列的检测。
[0009]本专利技术对荧光基团和淬灭基团不做具体限定，本领域技术人员可利用现有知识进行选择。在本专利技术的具体实施方式中，所述荧光基团包括但不限于FAM、Hex、TET、Cy3、JOE、ROX或VIC，所述淬灭基团包括但不限于Dabcyl、BHQI、BHQ2或TAMRA。
[0010]本专利技术的有益效果
[0011]利用热稳定性RNase H2核酸酶独特的切割作用，能在较高的温度条件下实现分子信标对靶序列的检测，优化分子信标技术的检测能力。
具体实施方式
[0012]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应当理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不能用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验，通常按照常规的实验条件，如分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Sambrook等人著)中所描述的实验条件，或按照设备或试剂盒制造厂商建议的实验条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均进行三次独立的重复实验。
[0013]实施例一、PaRNase H2蛋白的表达及纯化
[0014]Pyrococcus abyssi是一种嗜热菌，编码PaRNase H2(Gene ID:1495420；Locus tag:PAB_RS02765；蛋白编号:WP_010867642)核酸酶。PaRNase H2核酸酶能够耐受95℃的高温，适合于本专利技术目的应用。可以理解，除PaRNase H2核酸酶以外，其他的能够在高于室温的条件下，具有与PaRNase H2核酸酶类似作用的核酸酶，也能应用于本专利技术提供的分子信标检测，实现本专利技术的目的。
[0015]本实施例以PaRNase H2蛋白为例，说明热稳定性PaRNase H2蛋白的表达、纯化过程。
[0016]通过检索基因数据库，获得PaRNase H2蛋白的cDNA序列。对原始序列进行密码子优化，合成全长的cDNA序列，在其氨基末端加上六个连续的组氨酸标记，用于辅助表达蛋白的纯化。按照novagen公司提供的《PET系统操作手册》，将带有组氨酸标记的PaRNase H2蛋白序列插入到原核表达载体pet20b中，构建PaRNase H2表达载体。将该表达载体转入大肠杆菌，进行扩增，对获得的表达质粒进行基因测序验证。
[0017]获得测序正确的原核表达载体，再次转入大肠杆菌宿主细胞中，将其中的一个单克隆在37℃条件下培养过夜。取400uL过夜培养液，加入到100mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃条件下震荡培养3小时左右，使菌液的OD
600
值达到0.3
‑
0.6。加入0.5mM的IPTG溶液，在37℃条件下培养过夜，诱导蛋白表达。
[0018]按照常规的实验方案，利用镍柱纯化带有组氨酸标记的PaRNase H2蛋白，将纯化的PaRNase H2核酸酶进行定量，贮存于
‑
20℃条件下备用，贮存液成分为：10mM Tris pH 8.0、1mM EDTA、100mM NaCl、0.1％Triton X
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100、50％甘油。
[0019]对获得的PaRNase H2核酸酶进行活性测定，研究表明我们制备了纯化的PaRNase H2核酸酶。
[0020]实施例二、基于PaRNase H2核酸酶的分子信标检测
[0021]为了研究PaRNase H2核酸酶的对本专利技术提供的分子信标的切割作用，我们首先建立了基于PaRNase H2核酸酶的分子信标检测反应体系。进一步的，我们利用该反应体系，分析了三个信标分子对靶序列的检测情况。
[0022]1、分子信标及靶位点片段的设计、合成
[0023]针对三个被检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有茎环结构的寡聚核苷酸分子信标，其特征在于，所述信标分子中至少一个核苷酸为核糖核苷酸，其他的核苷酸为脱氧核糖核苷酸；所述信标分子的两个末端分别被荧光基团和荧光淬灭基团标记。2.一种用于体外核酸分子检测的检测组合物，其特征在于，所述检测组合物含有至少一种权利要求1所述的分子信标和至少一种具有RNase H2蛋白活性的蛋白质。3.权利要求2所述的检测组合物，其特征在于，所述具有RNase H2蛋白活性的蛋白质为热稳定性蛋白质；优选的，所述具有RNase H2蛋白活性的蛋白质为来源于Pyrococcus abyssi嗜热菌的RNase H2蛋白，以及上述蛋白的一个或多个氨基酸残基被取代、添加、缺失而形成的衍生蛋白质、上述蛋白的融合蛋白、以及为适应表达而对上述蛋白或其衍生蛋白进行密码子优化形成的衍生蛋白。4.一种在体外样本中进行基因检测的方法，包括以下步骤：1)提供权利要求2所述的检测组合物和含有至少一种被检测核酸分子的检测样本，所述检测组合物含有至少一种权利要求1所述的分子信标、至少一种具有RNase H2蛋白活性的蛋白质；所述分子信标能够与被检测核酸分子中具有序列同源性的目标核酸序列杂交；2)提供合适的反应条件，将检测组合物与检测样本进行接触，使分子信标与序列同源的目标核酸序列杂交；3)将反应体系置于40
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90℃条件下进行孵育，使具有RNase H2蛋白活性的蛋白质切割与目标核酸序列杂交的分子信标；4)检测被切割的分子信标的量。5.一种在体外样本中进行基因检测的方法，包括以下步骤：1)提供权利要求2所述的检测组合物和含有至少一种被检测核酸分子的检测样本，所述检测组合物含有至少一种权利要求1所述的分子信标、至少一种具有RNase H2蛋白活性的蛋白质；所述分子信标能够与被检测核酸分子中具有序列同源性的目标核酸序列杂交；2)提供合适的反应条件，使检测样本中的被检测核酸分子、或包含目标核酸序列的核酸片段进行等温扩增，获得等温扩增产物；3)提供合适的反应条件，将检测组合物与步骤2获得的等温扩增产物进行接触，使分子信标与序列同源的目标核酸序列杂交；4)将反应体系置于40
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90℃条件下进行孵育，使具有RNase H2蛋白活性的蛋白质切割与目标核酸序列杂交的分子信标；5)检测被切割的分子信标的量。6.一种在体外样本中进行基因检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提供权利要求2所述的检测组合物和含有至少一种被检测核酸分子的检测样本，所述检测组合物含有两种或两种以上的权利要求1所述的分子信标、至少一种具有RNase H2蛋白活性的蛋白质；所述两种或两种以上的分子信标分别被可区分的荧光基团标记；所述两种或两种以上的分子信标能够分别与被检测核酸分子中具有序列同源性的目标核酸序列杂交；2)提供合适的反应条件，将检测组合物与检测样本进行接触，使分子信标分别与序列同源的目标核酸序列杂交；3)将反应体系置于40
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90℃条件下进行孵育，使具有RNase H2蛋白活性的蛋白质切割
与目标核酸序列杂交的分子信标；4)利用与...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：枣庄康泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：