【技术实现步骤摘要】
一种反相色谱
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质谱联用的奇数碳链脂质分析方法
[0001]本专利技术属于奇数碳链脂质分析
，具体涉及一种反相色谱
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质谱联用的奇数碳链脂质分析方法。
技术介绍
[0002]奇数碳长链饱和脂肪酸(OCFAs)在天然脂类中广泛存在，在正常情况下其含量较少，约占高等动物脂肪酸含量的1～5％。过去由于研究方法以及检测技术的限制，绝大部分关于脂代谢的研究均聚焦于偶数碳链脂肪酸，而OCFAs由于含量低其精准检测及功能研究一度被忽略。尽管流行病学研究为我们提供了OCFAs与疾病风险相关性的初步结果，但这与偶数碳链脂肪酸的作用相矛盾，但阐明其潜在的功能的前提是对其进行精准检测，而这也取决于准确定量OCFAs在疾病发生发展中的动态变化及其参与形成复杂脂质的分布情况。另外，随着脂质组学分析技术的兴起和发展，大量研究利用该技术陆续发现了人体中C15:0，C17:0，C17:1、C19:1和C23:0的存在，从而使得衡量脂质的定量表征成为了可能，但OCFAs作为基本机构元件参与合成复杂脂质(如甘油酯、磷脂、鞘脂、神经酰胺、固醇酯)的情况及其分布仍不明确，因此亟需开发针对奇数碳链脂质的脂质组学分析方法，用于生物样本中该类型脂质的定量分析，从而探究疾病中OCFAs的动态变化以及绘制OCFAs参与形成复杂脂质的分布图谱。
技术实现思路
[0003]鉴于此，本专利技术旨在提供一种反相色谱
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质谱联用的奇数碳链脂质分析方法，该方法具有良好的重现性和稳定性，半高峰宽，变异系数...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种反相色谱
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质谱联用的奇数碳链脂质分析方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建奇数碳链脂质库：脂质库中的脂质均下载自脂代谢途径研究计划(LIPID MAPS，https://www.lipidmaps.org/databases/lmsd/browse)结构数据库和计算模拟，脂质库筛选标准为含有奇数碳链酰基FA13:0、FA15:0、FA15:1、FA17:0、FA17:1、FA17:2、FA19:0、FA19:1、FA21:0、FA23:0的胆固醇脂CE、甘油三酯TAG、甘油二酯DG、甘油一酯MAG、鞘脂SM、神经酰胺Cer、游离脂肪酸FFA、磷脂酸PA、磷脂酰胆碱PC、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰甘油PG、磷脂酰肌醇PI、磷脂酰丝氨酸PS；(2)构建奇数碳链脂质的质谱多级反应监测离子对(MRM)：MRM由母离子Q1和子离子Q3构成，其中正离子模式下构建CE、甘油酯TAG、DG、MAG、CER，DCER、HCER、LCER、SM的MRM离子对；负离子检测模式下构建磷脂含PA、PC、PE、PG、PS、PI以及FFA的MRM离子对；(3)脂质提取：脂质提取时加入内标物质Ultimate SPLASH
TM
ONE，脂质提取后用氮气流干燥提取物，加入工作液配成进样浓度，其中，工作液含有10mM乙酸铵的二氯甲烷(DCM)：甲醇(MeOH)，1:1，v/v；(4)液相色谱
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质谱分离：质谱条件：电喷雾离子源(ESI)采用正、负离子扫描模式，正离子模式下喷雾电压5200V，离子源温度350℃，雾化气40psi，气帘气55psi，脱溶剂气55psi；负离子模式下喷雾电压
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4500V，离子源温度600℃，雾化气35psi，气帘气60psi，脱溶剂气60psi；色谱条件：采用BEH C18色谱柱(2.1mm
×
50mm，1.8μm，Waters)，流动相A是甲醇:乙腈:水1:1:1,v/v/v,+5mM乙酸铵，流动相B是异丙醇+5mM乙酸铵；洗脱梯度为：0min20％B,1min 20％B,2.5min 40％B,4min 60％B,14min 90％B,15min 90％B,15.1min 20％B,17min 20％B，流速为0.2mL/min，色谱柱柱温设置为为40℃；(5)内标物液相分离及质谱测定：脂质组学内标物为Ultimate SPLASH
TM
ONE(Cat#330820L，Avanti)，内标物的MRM离子对构建按(2)所述规则进行构建；内标物液相色谱
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质谱分离采用(4)所述分离条件；(6)奇数碳链脂质库脂质保留时间预测：(6.1)内标保留时间获取：根据(4)所述分离条件以及(5)所述内标质谱裂解规律，在LC
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MS系统中获取内标的RT；(6.2)各类脂质保留时间预测：根据ECN模型，在反相液相色谱中，脂质保留时间与不饱和双键数或碳链长度符合二项拟合分布，基于此理论，根据(6.1)中的保留时间以及碳链长度构建脂质相对保留时间y与相对碳链长度x的二项拟合分布方程，其中y为脂质保留时间/色谱总洗脱时间17min，相对碳链长度为同类型脂质碳原子数/最大碳原子数，根据构建的脂质相对保留时间y与相对碳链长度x的二项拟合分布方程预测奇数碳链脂质库脂质保留时间；(7)根据奇数碳链脂质库脂质保留时间预测结果以及构建的MRM离子对，进行测试样中的奇数碳链脂质确认与定量。2.根据权利要求1所述的反相色谱
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质谱联用的奇数碳链脂质分析方法，其特征在于，所述(1)构建的奇数碳链脂质库的含奇数碳链脂质如No.1至No.678所示。3.根据权利要求1所述的反相色谱
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质谱联用的奇数碳链脂质分析方法，其特征在于，所述(2)中构建奇数碳链脂质的质谱多级反应监测MRM离子对的正离子模式下Q1构建遵循
以下特征：CE、MAG、SM、CER、DCER、HCER、LCER为[M+H]
+
，DG、TAG为[M+NH4]
+
；Q3构建遵循以下特征：CE的Q3质荷比(m/z)为369，SM m/z为184，CER m/z为264，DCER m/z为266，HCER m/z为264，LCER m/z为264；MAG根据中性丢失碎片NLS为丙二醇残基，质量数为74，确定Q3的m/z为Q1
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74；DG中Q3的m/z为奇数碳链酰基质量数+头部基团丙二醇残基74Da，即奇数碳链酰基质量数+74，此外，不饱和度增加1，Q3的m/z相应减少2；TAG中Q3的m/z为Q1
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NLS，其中NLS为奇数碳链酰基质量数+34；负离子模式下Q1构建遵循以下特征：PC的Q1质荷比m/z为[M+乙酰基AcO]
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、其余PA、PE、PG、PI、PS的Q1 m/z为为[M
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H]
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；根据各类脂质的中性丢失碎片NLS特征，Q3的m/z为Q1
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NLS，其中PA的NLS为153+脂酰基质量数，PC的NLS为298+脂酰基质量数，PE的NLS为196+脂酰基质量数，PG的NLS为227+脂酰基质量数，PI的NLS为315+脂酰基质量数，PS的NLS为240+脂酰基质量数，FFA的Q1＝Q3，m/z为[M
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H]
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。4.根据权利要求1所述的反相色谱
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质谱联用的奇数碳链脂质分析方法，其特征在于，所述(3)中，脂质提取方法包括如下：(3.1)组织样本脂质提取方法：(3.1.1)组织样本准备：(3.1.1.1)用滤纸干燥组织，称取50.0mg组织样品，放入2mL圆底离心管中；(3.1.1.2)加入500μL生理盐水，生理盐水制备方法如下：向100mL去离子水中加入0.85g NaCl，然后加入40μL冰醋酸；(3.1.1.3)研磨：放入2个大磁珠；(3.1.1.4)将样品管放入组织匀浆仪中，分两次匀浆，每次30秒，间隔10秒，以避免温度升高；(3.1.1.5)将匀浆以12000rpm离心15分钟，并用于进一步的脂质提取；(3.1.2)组织样本脂质提取：(3.1.2.1)将组织匀浆上清液50μL和5μL Ultimate SPLASH
TM
ONE内标加入玻璃管中，然后加入950μL H2O、2mL MeOH和0.9mL DCM；轻轻振动管子5秒，此时不会发生分层，如果分层，需额外添加50μL MeOH；(3.1.2.2)然后将管在室温下放置30分钟，然后依次加入1mL H2O和0.9mL DCM；将试管轻微振动5秒，然后以2000rpm离心15分钟，直到液体分层；(3.1.2.3)将分层的底层液体用移液枪转移到新的玻璃管中，并将1.8mL DCM添加到原始管中进行第二次提取；在上述步骤之后，将第二次提取物与第一个相合并；然后，用稳定的氮气流干燥提取物；(3.1.2.4)随后将100μL工作溶液加入到管中以使其溶解；然后在台式振动器上摇动样品，使其充分混合，并转移到200μL LC/MS内插管中；将内插管放入1.5mL塑料EP管中，以16000rpm离心10分钟；离心后将内插管转移到LC
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MS进样瓶中；(3.1.2.5)取每个样品的10μL放入QC管中，随后用作对照，并充分混合；最后，将LC
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MS进样瓶中的脂质提取物保存在
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80℃冰箱中，直到LC
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MS/MS分析；(3.2)血浆样本脂质提取方法：(3.2.1)血浆样本预处理：(3.2.1.1)使用EDTA抗凝，5mL紫头管收集血液；(3.2.1.2)1500g离心5min；
(3.2.1.3)取上清2mL，分装1.5mL容量的EP管，
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80℃保存；每次使用样本量体积为25μL；(3.2.2)血浆脂质提取：(3.2.2.1)把血清或血浆复溶到室温；加25μL血清或细胞上清到玻璃管中；(3.2.2.2)加975μL H2O，2mL MeOH，0.9mL二氯甲烷DCM；(3.2.2.3)轻轻震荡5s，此时不出现分层，若出现再加50μL MeOH；加入适量内标，混匀；(3.2.2.4)室温放置30min；加1mL H2O和0.9mL DCM；(3.2.2.5)轻微震荡5s；2000rpm离心15min，直到液体分层，后转移下层液体到一个新的玻璃离心管；(3.2.2.6)在原管中加1.8mL DCM，重复提取一次；轻轻震荡5s，2000rpm高速离心10min，直到液体分层；(3.2.2.7)氮气吹干合并的下层DCM中的有机相，然后加100μL工作液溶解在塑料EP管中；(3.2.2.8)在台式震荡仪上震荡样本，混匀，然后16000rpm离心10min，吸取90μL样本，转移到玻璃的小样本管子中；(3.2.2.9)从所有样本中每个各取20μL混合成一管QC后续作为对照。5.根据权利要求1所述的反相色谱
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质谱联用的奇数碳链脂质分析方法，其特征在于，所述(5)中内标物的MRM(Q1>Q3)离子对构建如下：17:0
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14:1DG
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d5+NH4
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IS(575.5>332.2)、17:0
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16:1DG
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d5+NH4
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IS(603.5>332.2)、17:0
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18:1DG
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d5+NH4
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IS(631.6>332.2)、17:0
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20:3DG
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d5+NH4
‑
IS(655.6>332.2)、17:0
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22:4DG
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d5+NH4
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IS(681.6>332.2)、14:0
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13:0
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14:0TAG
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d5+NH4
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IS(731.7>486.4)、14:0
‑
15:1
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14:0TAG
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d5+NH4
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IS(757.7>512.4)、14:0
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17:1
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14:0TAG
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d5+NH4
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IS(785.7>540.5)、16:0
‑
15:1
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16:0TAG
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d5+NH4
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IS(813.7>540.5)、16:0
‑
17:1
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16:0TAG
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d5+NH4
‑
IS(841.8>568.5)、16:0
‑
19:2
‑
16:0TAG
‑
d5+NH4
‑
IS(867.8>594.5)、18:1
‑
17:1
‑
18:1TAG
‑
d5+NH4
‑
IS(893.8>594.5)、18:1
‑
19:2
‑
18:1TAG
‑
d5+NH4
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IS(919.8>620.5)、18:1
‑
21:2
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18:1TAG
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d5+NH4
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IS(947.8>648.6)、14:1cholesteryl
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d7 ester
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IS(619.6>376.4)、16:1cholesteryl
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d7ester
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IS(647.6>376.4)、18:1cholesteryl
‑
d7 ester
‑
IS(675.6>376.4)、20:3cholesteryl
‑
d7ester
‑
IS(699.6>376.4)、22:4cholesteryl
‑
d7 este...
【专利技术属性】
技术研发人员：李咏生，张建钢，何永鹏，雷娟，周宇，
申请(专利权)人：重庆大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：
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