金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测荧光探针、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT

【技术实现步骤摘要】
金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT
‑
PCR检测荧光探针、试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于病毒分子检测
，具体涉及一种金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT
‑
PCR检测荧光探针、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]茄科植物包括番茄(Lycopersicon esclulantum Mill)、马铃薯(Solanum tuberosum L.)、辣椒(Capsicum annuum L.)、烟草(Nicotiana tabacum L.)等重要蔬菜、经济和大田作物，在世界范围内广泛栽培，具有重要的经济价值。特别是马铃薯和番茄，分别是世界第一和第二大具有经济要性的蔬菜，在全世界173个国家种植。但茄科植物也是重要的病毒和类病毒寄主，被病毒或类病毒侵染后产量或品质降低，造成严重的经济损失。类病毒是一类环状闭合的单链RNA分子，分子量约105Da，含246～401个核苷酸。类病毒是比已知病毒都小的能在宿主细胞内自主复制的病原体之一，它们不编码蛋白质，但会引起不同严重程度的症状，从轻微的影响，如几乎看不到的生长减缓，到变形、坏死或褪绿，以及受感染植物的严重发育不良。
[0003]金鱼草潜隐类病毒(Columnea latent viriod，CLVd)属于马铃薯纺锤形块茎类病毒属，是番茄上最严重的病害之一。CLVd的宿主范围主要限于茄科的成员，如番茄、马铃薯、茄子、辣椒、矮牵牛，此外还包括食用菊花和黄瓜等。CLVd主要以机械方式通过种子传播。CLVd引起的症状与其他马铃薯纺锤形块茎类病毒属非常相似，包括发育迟缓等，主要在几种茄属植物上观察到。在易感寄主中，可以在部分植株部位发现扭曲和静脉坏死等症状。这种类病毒侵染番茄后可导致番果实变小和种子产量减少。
[0004]我国研究人员很少在种子中对金鱼草潜隐类病毒开展检测研究，缺乏相应的检测技术和检测产品，但在国外有要求对番茄(S.lycopersicum)、野生番茄(S.chilense)、克梅留斯基番茄(S.chmielewskii)、小花茄(S.peruvianum)及细叶番茄(S.pimpinellifolium)的金鱼草潜隐类病毒的强制性检测。
[0005]该类病毒在我国的茄科植物上尚未被报道，目前尚未有专门针对该类病毒的检测专利和标准等相关报道，这将对茄科植物感染CLVd的诊断和防控带来非常负面的影响，因此设计建立金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测体系，实现对其快速、精确检测非常必要，这对金鱼草潜隐类病毒监测预警以及国门生物安全等方面具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测引物、荧光探针、试剂盒及应用，采用的具体技术方案如下。
[0007]一种金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测荧光探针，序列为：5'
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FAM
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CGTCAGCACCTGCGCTGGTCAAGAGGTT
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BHQ1
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3'。
[0008]而且，与所述荧光探针配合使用的引物的核苷酸序列为：
[0009]正向引物：5'
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GGGTTTTCACCCTTCCTTTC
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3'；
[0010]反向引物：5'
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TGTTTCWRCDGGGATTACTCCTG
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3'。
[0011]一种金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测试剂盒，至少包括上述的荧光探针和引物。
[0012]以及上述金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测荧光探针、引物或试剂盒在检测金鱼草潜隐类病毒中的应用。
[0013]特别是从马铃薯纺锤块茎类病毒、金鱼草潜隐类病毒、辣椒小果类病毒、番茄顶缩类病毒、番茄褪绿矮缩类病毒和番茄雄性株类病毒这6种马铃薯纺锤形块茎类病毒属中鉴别出金鱼草潜隐类病毒。
[0014]而且，试剂盒还包括TaqMan实时荧光PCR扩增预混液和阳性质粒。
[0015]而且，阳性质粒是将SEQ ID NO.1所示序列插入pGEM
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T载体中获得。
[0016]而且，用该试剂盒检测金鱼草潜隐类病毒的方法为：
[0017]步骤1.提取待测样品的RNA并逆转录为cDNA；
[0018]步骤2.实时荧光PCR体系为：TaqMan实时荧光PCR扩增预混液12.5μL，上下游引物(10μmol/mL)各1.0μL，TaqMan探针(10μmol/mL)0.5μL，cDNA模板3.0μL，用ddH2O补充至总体积为25μL；实时荧光PCR反应条件为：50℃2min、95℃10min、95℃15s、60℃1min，40个循环；
[0019]步骤3.检测结果判定：Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，则结果为阳性；无Ct值或无扩增曲线，结果为阴性；Ct值>35时，重做该样本，若重做结果无Ct值为阴性，否则为阳性。
[0020]与现有技术相比，本技术方案的有益效果在于：1、提供一种金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测引物和荧光探针，适用于荧光定量PCR扩增，特异性好，灵敏度高，适合于在植物病害诊断领域广泛推广应用；2、通过实验验证该引物和荧光探针能准确地从6种马铃薯纺锤形块茎类病毒属中鉴别出金鱼草潜隐类病毒，特异性达100％，这6种马铃薯纺锤形块茎类病毒属包括马铃薯纺锤块茎类病毒PSTVd、金鱼草潜隐类病毒CLVd、辣椒小果类病毒PCFVd、番茄顶缩类病毒TASVd、番茄褪绿矮缩类病毒TCDVd和番茄雄性株类病毒TPMVd；3、提供一种金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测试剂盒，该试剂盒操作简便，特异性强，灵敏度高，检测限达1fg/μL，并且在100ng/μL
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1fg/μL范围内定量准确；4、提供了试剂盒的检测方法，该检测方法通过标准曲线实现对供试材料中金鱼草潜隐类病毒的定量检测；整个过程只需要1.5h左右，与常规PCR技术相比，大大缩短了检测时间；检测结果可由电脑软件直接读出，不需要进行反应后处理，所以避免了检测结果假阳性的产生及环境的污染；5、对金鱼草潜隐类病毒的进出口预警监测以及国门生物安全等方面具有重要意义。
附图说明
[0021]图1为金鱼草潜隐类病毒(CLVd)荧光定量PCR方法的标准曲线。
[0022]图2为金鱼草潜隐类病毒(CLVd)荧光定量PCR方法的敏感性分析的扩增曲线；对不同浓度参考品的线性与灵敏度进行实时荧光PCR检测分析，其中反应体系中cDNA含量分别为1：100ng/μL；2：10ng/μL；3：1ng/μL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测荧光探针，其特征在于序列为：5'
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FAM
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CGTCAGCACCTGCGCTGGTCAAGAGGTT
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BHQ1
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3'。2.根据权利要求1所述的一种金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测荧光探针，其特征在于，与所述荧光探针配合使用的引物的核苷酸序列为：正向引物：5'
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GGGTTTTCACCCTTCCTTTC
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3'；反向引物：5'
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TGTTTCWRCDGGGATTACTCCTG
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3'。3.一种金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测试剂盒，其特征在于：至少包括权利要求1所述的荧光探针和权利要求2所述的引物。4.根据权利要求1～3中任一项所述金鱼草潜隐类病毒TaqMan实时荧光定量RT
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PCR检测荧光探针、引物或试剂盒在检测金鱼草潜隐类病毒中的应用。5.根据权利要求4所述的应用为从马铃薯纺锤块茎类病毒、金鱼草潜隐类病毒、辣椒小果类病毒、番茄顶缩类病毒、番茄褪绿矮缩类病毒和番茄雄性株类病毒这...

【专利技术属性】
技术研发人员：王振华，徐文兴，王琴，曾宪东，李乔，孙俊，徐雪，熊永红，张建坤，
申请(专利权)人：华中农业大学武汉理工大学，
类型：发明
国别省市：