本发明专利技术公开了一种热稳定性提升的肌酸脒基水解酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明专利技术通过对产碱杆菌来源的肌酸脒基水解酶进行无系统发育偏见的共识设计，获得热稳定性显著提高的突变酶。与野生型半衰期相比，最优组合突变体最高半衰期提升2841倍，这表明突变体相比于野生型，其稳定性得到了显著的提升。其稳定性得到了显著的提升。
【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性提高的肌酸脒基水解酶突变体
[0001]本申请是以下申请的分案申请：申请日：2020年8月28日；申请号：202010886832.3；专利技术名称“一种热稳定性提高的肌酸脒基水解酶突变体”。
[0002]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种热稳定性提高的肌酸脒基水解酶突变体。
技术介绍
[0003]肌酸脒基水解酶是酶促方法检测肌酐含量的必不可少的酶，它能够将肌酸转化成肌氨酸和尿素，进一步生成能够进行化学检测的过氧化氢。该酶主要来源于微生物，目前已被广泛应用于医疗诊断、有机合成等行业。
[0004]肌酸脒基水解酶用于工业上测定肌酐含量，除此之外，也经常被用于临床分析诊断血清和尿液中肌酐含量和与健康机体中肌酐含量不同的肾脏疾病。肌酐是应用人体磷酸肌酸代谢的最终产物，经肾脏过滤后，再从血液中进入尿液，排出体外。一般来说，血清肌酐的正常范围在35～150μm之间，但当肾功能或肌肉功能出现问题时，肌酐含量会上升至1000μm，血液和尿液中的肌酐含量可以反映肾脏的排泄功能。目前为止检测肌酐含量最常用的是Jaffe化学检测方法和酶比色法。相比之下，由于酶促检测法较高的灵敏度和选择性等特点，日益受到关注。在酶促检测方法中，待测样品通过肌肝水解酶，肌酸脒基水解酶和肌氨酸氧化酶连续转化，最终肌酐被降解为过氧化氢，通过在辣根过氧化物酶催化下的比色反应来确定过氧化氢的浓度，从而达到检测肌酐含量的目的。
[0005]因此，为了更好的将肌酸脒基水解酶应用于临床肌酐检测，本专利技术利用共识设计方法获得了热稳定性提高的的肌酸脒基水解酶突变体、本专利技术采用基于传统的共识方法改进的无系统发育偏见的共识方法筛选得到21个氨基酸突变位点并对其进行定点突变，获得了热稳定显著提升的突变酶，解决了现有的肌酸脒基水解酶热稳定性差的缺陷不能满足应用于试剂的需求，为拓宽肌酸脒基水解酶的工业应用奠定了基础。
技术实现思路
[0006]为了更好的将肌酸脒基水解酶应用于临床肌酐检测，本专利技术利用共识设计方法获得了热稳定性提高的的肌酸脒基水解酶突变体、本专利技术采用基于传统的共识方法改进的无系统发育偏见的共识方法筛选得到21个氨基酸突变位点并对其进行定点突变，获得了热稳定显著提升的突变酶，解决了现有的肌酸脒基水解酶热稳定性差的缺陷不能满足应用于试剂的需求，为拓宽肌酸脒基水解酶的工业应用奠定了基础。
[0007]本专利技术第一个目的是提供一种肌酸脒基水解酶的突变体，所述肌酸脒基水解酶突变体氨基酸序列为如下(a1)或(a2)所示：
[0008](a1)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQ ID NO.1的蛋白具有相同功能的衍生蛋白；
[0009](a2)通过一个或多个氨基酸残基取代SEQ ID NO.1示的氨基酸序列的一个或多个位置且与SEQ ID NO.1示的蛋白表现出至少92％同源性的衍生蛋白。
[0010]优选地，该肌酸脒基水解酶突变体，SEQ ID NO.1示的氨基酸序列的突变位点包括以下至少一个：第6位、第17位、第58位、第108位、第117位、第165位、第199位、第251位、第349位及第351位。
[0011]进一步优选地，该肌酸脒基水解酶突变体，所述肌酸脒基水解酶突变体包括在SEQ ID NO.1示的氨基酸序列上L6P、D17V、G58D、F108Y、T117P、Q165I、T199S、T251C、E349V、K351E中任一单点突变位点的单点突变体。
[0012]进一步优选地，该肌酸脒基水解酶酶突变体，所述肌酸脒基水解酶突变体包括在SEQ ID NO.1示的氨基酸序列上L6P/D17V、D17V/G58D、D17V/T251C、D17V/K351E、D17V/T199S、D17V/F108Y、D17V/Y109F、D17V/Q165I、D17V/E349V、D17V/T199S/T251C、D17V/F108Y/T199S、D17V/Y109F/T199S、D17V/T199S/K351E、L6P/D17V/T199S、L6P/D17V/T199S/K351E、L6P/D17V/F108Y/T199S、D17V/T199S/L6P/、L6P/D17V/Y109F/T199S/T251C、L6P/D17V/F108Y/T199S/K351E、L6P/D17V/Y109F/T199S/K351E、L6P/D17V/T199S/K351E/T251C等组合突变体。
[0013]本专利技术的第二个目的是提供编码所述肌酸脒基水解酶突变体的基因。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2核苷酸序列。
[0015]本专利技术的第三个目的是提供含有所述基因的载体。
[0016]本专利技术的第四个目的是提供表达所述突变体的细胞。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞为真菌细胞或细菌细胞。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞为大肠杆菌、酵母或枯草芽孢杆菌。
[0019]本专利技术的第五个目的是提供32种提高肌酸脒基水解酶热稳定性的突变体，包括以下步骤：
[0020]1、在NCBI数据库中搜索SEQ ID NO.1的氨基酸序列，删除重复出现的相同序列，选取与SEQ ID NO.1氨基酸序列一致性大于50％的氨基酸序列；
[0021]2、然后通过ClustalX2.1软件进行多序列比对，将剩余氨基酸质序列整理成fasta.文件导入到MEGA7.0软件，利用其Phylogenetic模块中NJ算法构建系统发育树；
[0022]3、根据系统发育树的分支距离引入权重，通过python脚本计算consensus sequence，结合同源建模结构筛选出热稳定性相关的突变位点为L6P,D17V,P20T,V33L,C52N,G58D,W59F,D73T,F108Y,Y109F,T117P,L162A,V340L,Q165I,V362I,T199S,K166A，T251C,C331S,E349V,K351E。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将GenBank登录号为BAA88830.1的肌酸脒基水解酶的以下位点进行突变：
[0024](1)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第6位亮氨酸被脯氨酸取代，记为L6P；
[0025](2)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第17位天冬氨酸被缬氨酸取代，记为D17V；
[0026](3)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第58位甘氨酸被天冬氨酸取代，记为G58D；
[0027](4)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第108位苯丙氨酸被酪氨酸取代，记为F108Y；
[0028](5)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第117位苏氨酸被脯氨酸取代，记为T117P。
[0029](6)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第165位谷氨酰胺被异亮氨酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种肌酸脒基水解酶突变体，其特征在于，所述肌酸脒基水解酶突变体为GenBank登录号为BAA88830.1所示氨基酸序列的E349V单点突变体。2.一种编码如权利要求1所述肌酸脒基水解酶酶突变体的基因。3.一种包含如权利要求2所述的基因的重组质粒。...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨广宇，白雪，罗漫杰，徐灿，
申请(专利权)人：上海瀚诺威生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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