一种表观调节因子DOT1L在肌肉分化中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种表观调节因子DOT1L在肌肉分化中的应用，该应用包括：为肌肉分化失调相关疾病，如共济失调、肌少症和骨质疏松提供新的治疗靶点。鉴定表观调节因子DOT1L在肌肉分化中作用的方法包括：分析体外检测DOT1L对肌肉细胞分化的调控；分析体外检测DOT1L对肌肉细胞功能的影响；体内检测DOT1L对肌肉细胞分化和功能的影响；DOT1L通过线粒体通透性转换孔调节肌肉分化和功能的分子机制；DOT1L通过ROS/Sirt1/PGC1

【技术实现步骤摘要】
一种表观调节因子DOT1L在肌肉分化中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种表观调节因子DOT1L在肌肉分化中的应用。

技术介绍

[0002]肌肉分化与疾病的关系，以及目前肌肉分化领域内的研究，特别是表观遗传在肌肉分化中的重要作用需要阐明。表观遗传因子DOT1L是目前发现的唯一一个组蛋白H3K79甲基化酶。DOT1L通过调节H3K79甲基化程度影响机体多种分化发育过程，如胚胎发育、心肌细胞分化、软骨细胞分化和破骨细胞分化。肌肉细胞分化同属于细胞分化进程，然而未见报道DOT1L调节肌肉细胞分化的实例。与破骨细胞相似，肌肉细胞的分化进程与单细胞融合为多核细胞密不可分，以往研究表明DOT1L可以抑制破骨细胞分化，降低骨丢失，达到骨保护作用。那么在肌肉分化中，DOT1L是否同样扮演抑制肌肉细胞分化作用，以及DOT1L调节肌肉细胞分化的具体机制如何，需要在本专利技术中新一步明确。
[0003]通过上述分析可见，现有技术中关于DOT1L调节肌肉细胞分化的实例尚未见报道，且DOT1L及其调节的通路能否成为治疗肌肉代谢相关疾病的潜在靶点仍需进一步验证。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种表观调节因子DOT1L在肌肉分化中的机制及应用，填补现有技术中DOT1L在肌肉细胞分化中应用实例空缺。
[0005]本专利技术的另一目的是为肌肉分化失调相关代谢疾病，如共济失调、肌少症和骨质疏松等的治疗寻找潜在的关键性靶点及小分子抑制剂。
[0006]本专利技术从体外作用、体内验证和分子机制三个层面实现表观调节因子DOT1L在肌肉分化中的应用，包括以下五个步骤：
[0007]1.体外检测DOT1L对肌肉细胞分化的调控；
[0008]2.体外检测DOT1L对肌肉细胞功能的影响；
[0009]3.体内验证DOT1L对肌肉细胞分化和功能的影响；
[0010]4.DOT1L通过线粒体通透性转换孔调节肌肉分化和功能的分子机制；
[0011]5.DOT1L通过MPTP介导ROS/Sirt1/PGC1
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α通路进而影响肌细胞因子Irisin的分泌。
[0012]本专利技术从体外作用、体内验证和分子机制三个层面实现表观调节因子DOT1L在肌肉分化中的应用，具体包括：
[0013]A、在体外细胞水平明确表观调节因子DOT1L对肌肉细胞分化和功能的作用，包括利用慢病毒敲低过表达手段和使用小分子抑制剂干扰DOT1L表达水平或酶活力后，利用WB、ELISA、免疫荧光等检测成肌分化能力、肌细胞存活时间、以及肌细胞因子分泌量的变化。
[0014]B、利用小鼠模型，在体内检测DOT1L对肌肉细胞分化和功能的影响，包括构建肌卫星细胞特异性DOT1L敲除的小鼠，建立骨骼肌急性损伤模型，观察DOT1L敲除后骨骼肌再生
情况，并检测肌肉注射DOT1L抑制剂后肌力、抓力和血清肌细胞因子含量。
[0015]C、使用分子生物学和生物化学方法进一步解析DOT1L通过调节线粒体转换孔开放进一步调节肌肉分化和功能：DOT1L表观调节线粒体通透性转换孔相关蛋白CypD与ANT，并进一步影响ROS/Sirt1/PGC1
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α通路，最终调节肌肉功能和肌细胞分化因子Irisin分泌。
[0016]进一步，所述表观调节因子DOT1L为组蛋白H3K79甲基化酶。
[0017]进一步，所述表观调节因子DOT1L在肌肉分化中的应用包括：为肌肉分化失调相关疾病提供新的治疗靶点及小分子抑制剂。
[0018]进一步，所述肌肉分化失调相关疾病包括共济失调、肌少症和骨质疏松。
[0019]本专利技术的另一目的在于提供一种鉴定所述表观调节因子DOT1L在肌肉分化中作用的方法，所述鉴定表观调节因子DOT1L在肌肉分化中作用的方法包括以下步骤：
[0020]步骤一，分析体外检测DOT1L对肌肉细胞分化的调控；
[0021]步骤二，分析体外检测DOT1L对肌肉细胞功能的影响；
[0022]步骤三，分析体内检测DOT1L对肌肉细胞分化和功能的影响；
[0023]步骤四，DOT1L通过线粒体通透性转换孔调节肌肉分化和功能的分子机制；
[0024]步骤五，DOT1L通过ROS/Sirt1/PGC1
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α通路调节MPTP。
[0025]进一步，所述步骤一中的体外检测DOT1L对肌肉细胞分化的调控包括：
[0026](1)建立C2C12细胞系体外肌肉分化模型；
[0027](2)DOT1L小分子抑制剂刺激体外肌肉分化模型；
[0028](3)构建DOT1L敲低/敲除的C2C12细胞系，分析敲除对肌肉细胞分化的影响。
[0029]进一步，所述步骤二中的体外检测DOT1L对肌肉细胞功能的影响包括：
[0030](1)CCK
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8检测DOT1L抑制剂/敲低DOT1L后对肌肉细胞增殖的影响；
[0031](2)流式检测DOT1L抑制剂/敲低DOT1L后对肌肉细胞凋亡和细胞周期的影响；
[0032](3)ELISA检测DOT1L抑制剂/敲低DOT1L后对肌肉细胞因子Irisin和Myostatin分泌的影响。
[0033]进一步，所述步骤三中的体内检测DOT1L对肌肉细胞分化和功能的影响，包括：
[0034](1)构建肌卫星细胞特异性DOT1L敲除的小鼠；
[0035](2)腹腔注射tamoxifen条件性诱导DOT1L敲除；
[0036](3)骨骼肌急性损伤造模；
[0037](4)分析DOT1L敲除后骨骼肌再生情况；
[0038](5)肌肉注射DOT1L抑制剂，检测肌力、抓力和血清肌细胞因子含量。
[0039]进一步，所述步骤四中的DOT1L通过线粒体通透性转换孔调节肌肉分化和功能的分子机制包括：
[0040](1)流式检测线粒体通透性转换孔MPTP的开放情况；
[0041](2)Westernblot和IF检测MPTP关键蛋白CypD与ANT的表达和定位；
[0042](3)在DOT1L敲低细胞系中使用CyclosporinA抑制MPTP，分析肌肉细胞分化和肌肉因子分泌情况；
[0043](4)分离肌卫星细胞特异性DOT1L敲除小鼠的肌肉细胞，使用Cyclosporin A抑制MPTP，分析肌肉细胞分化和肌肉因子分泌情况；
[0044](5)在肌卫星细胞特异性DOT1L敲除小鼠肌肉中注射CyclosporinA，检测小鼠肌张
力和抓力；
[0045](6)免疫共沉淀结合质谱技术寻找DOT1L调节CypD的转录调节因子。
[0046]进一步，所述步骤五中的DOT1L通过ROS/Sirt1/PGC1
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α通路调节MPTP，包括：
[0047](1)Westernblot检测MPTP抑制剂作用前后Sirt1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表观调节因子DOT1L在肌肉分化中的应用。2.如权利要求1所述表观调节因子DOT1L在肌肉分化中的应用，其特征在于，所述表观调节因子DOT1L为组蛋白H3K79甲基化酶。3.如权利要求1所述表观调节因子DOT1L在肌肉分化中的应用，其特征在于，所述表观调节因子DOT1L在肌肉分化中的应用包括：为肌肉分化失调相关疾病提供新的治疗靶点及小分子抑制剂；其中，所述肌肉分化失调相关疾病包括共济失调、肌少症和骨质疏松。4.一种鉴定如权利要求1～3任意一项所述表观调节因子DOT1L在肌肉分化中作用的方法，其特征在于，所述鉴定表观调节因子DOT1L在肌肉分化中作用的方法包括以下步骤：步骤一，分析体外检测DOT1L对肌肉细胞分化的调控；步骤二，分析体外检测DOT1L对肌肉细胞功能的影响；步骤三，体内检测DOT1L对肌肉细胞分化和功能的影响；步骤四，DOT1L通过线粒体通透性转换孔调节肌肉分化和功能的分子机制；步骤五，DOT1L通过ROS/Sirt1/PGC1
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α通路调节MPTP。5.如权利要求4所述鉴定表观调节因子DOT1L在肌肉分化中作用的方法，其特征在于，所述鉴定表观调节因子DOT1L在肌肉分化中作用的方法还包括：(1)在体外细胞水平明确表观调节因子DOT1L对肌肉细胞分化和功能的作用，包括利用慢病毒敲低过表达手段和使用小分子抑制剂干扰DOT1L表达水平或酶活力后，利用WB、ELISA和免疫荧光检测成肌分化能力、肌细胞存活时间、以及肌细胞因子分泌量的变化；(2)利用小鼠模型，在体内检测DOT1L对肌肉细胞分化和功能的影响，包括构建肌卫星细胞特异性DOT1L敲除的小鼠，建立骨骼肌急性损伤模型，观察DOT1L敲除后骨骼肌再生情况，并检测肌肉注射DOT1L抑制剂后肌力、抓力和血清肌细胞因子含量；(3)使用分子生物学和生物化学方法解析DOT1L通过调节线粒体转换孔开放调节肌肉分化和功能：DOT1L表观调节线粒体通透性转换孔相关蛋白CypD与ANT，并影响ROS/Sirt1/PGC1
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α通路，最终调节肌肉功能和肌细胞分化因子Irisin分泌。6.如权利要求4所述鉴定表观调节因子DOT1L在肌肉分化中作用的方法，其特征在于，所述步骤一中的体外检测DOT1L对肌肉细胞分化的调控包括：(1)建立C2C12细胞系体外肌肉分化模型；(2)DOT1L小分子抑制剂刺激体外肌肉分化模型；(3)构建DOT1L敲低/敲除的C2C12细胞系，分析敲除对肌肉细胞分化的影响。7.如权利要求4所述鉴定表观调节因子DOT1L在肌肉分化中作用的方法，其特征在于，所述步骤二中的体外检测DOT1L对肌肉细胞功能的影响包括：(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：高延盼，谢雍，潘蒙，王霞，孟姝，葛微，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：