一种积累麦角新碱的菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种能够积累麦角新碱的基因工程菌株，所述基因工程菌株的出发菌株为能够产生麦角新碱和lysergic acidα

【技术实现步骤摘要】
No.1所示序列具有高度同源性或同一性的序列，并且来源于雀稗麦角菌中的FAD依赖的单加氧酶；优选的，所述高度同源性或同一性包括与目的序列的同源性或同一性至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％或至少60％的序列。
[0010]在一个实施方式中，所述FAD依赖的单加氧酶的核酸序列如SEQ ID No.2所示；在其他的实施方式中，所述FAD依赖的单加氧酶来源于雀稗麦角菌，并且SEQ ID No.2具有至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％或至少60％的序列同源性或序列同一性。
[0011]在一个实施方式中，所述雀稗麦角菌包括Claviceps paspali RRC1481、CCC130、ATCC13892和DSMZ 833中的一种或任意几种。
[0012]另一方面，本专利技术还提供了利用所述基因工程菌株生产麦角新碱的方法，所述方法包括将所述菌株接种至培养基中进行发酵的步骤。
[0013]在一个实施方式中，发酵条件如下：发酵温度24℃～29℃、发酵时间8～14天。
[0014]本专利技术中，所述基因工程菌株与野生型雀稗麦角菌相比，只积累麦角新碱而不积累LAH(lysergic acidα
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hydroxyethylamide)，发酵完毕后，更便于分离和纯化麦角新碱。
[0015]在其他的实施方式中，本专利技术所述的方法还包括分离或纯化麦角新碱的步骤。
[0016]另一方面，本专利技术还提供了一种制备麦角新碱的方法，所述方法包括利用上述基因工程菌株发酵生产麦角新碱的步骤。进一步的，所述方法还包括对麦角新碱进行分离或纯化的步骤。
[0017]另一方面，本专利技术还提供了上述基因工程菌的构建方法。
[0018]本专利技术所述的构建方法包括对出发菌株雀稗麦角菌(Claviceps paspali)的FAD依赖的单加氧酶(g5173)进行基因突变的步骤。
[0019]另一方面，本专利技术还提供了上述基因工程菌在制备或生产麦角新碱中的应用。
[0020]在一个实施方式中，本专利技术的基因工程菌株为雀稗麦角菌(Claviceps paspali)Cp
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Δg5173，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.23899，保藏日期为2021年12月31日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010
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64807355。
附图说明
[0021]此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0022]图1.质粒pJJL
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13图谱。
[0023]图2.工程菌株构建示意图，其中，A：构建策略示意图；B：用引物yanzheng
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F/yanzheng
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R引物对进行基因组PCR验证结果，M为DNA marker，泳道1
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6为候选的Cp
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Δg5173工程菌株，泳道7为出发菌株雀稗麦角菌。
[0024]图3.Cp
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Δg5173工程菌株与野生型菌株次级代谢产物HPLC分析。
[0025]图4.野生型菌株次级代谢产物HRESIMS分析，其中A：化合物1的质谱结果及推测分子式；B:化合物2的质谱结果及推测分子式。
具体实施方式
[0026]结合以下具体实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的保护内容不局限于以下实施例。在不背离专利技术构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本专利技术中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。如按照Sambrook等人，分子克隆，实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)所记载，或按照厂商的建议条件。
[0027]PDB液体培养基：24g/L马铃薯土豆培养基PDB干粉(BD公司产品，产品目录号：7114771)，余量为去离子水，115℃高压灭菌30分钟。
[0028]酶解液：称取0.1～0.5g Lysing Enzyme(Sigma产品，产品目录号：L1412)、0.01～0.2g溶壁酶(广东省微生物研究所)溶解于5～20mL的0.5～0.8M KCl水溶液中，经由0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。
[0029]本专利技术中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒(D6942
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01)，DNA片段和凝胶回收是采用北京庄盟国际生物基因科技有限公司V
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ELUTE Gel Mini Purification Kit(ZPV202)。
[0030]PDB顶层琼脂：24g/L马铃薯土豆培养基PDB干粉(BD公司产品，产品目录号：7114771)，0.2M蔗糖，5g/L琼脂糖，余量为去离子水，115℃高压灭菌30分钟后50℃保温。
[0031]PDA平板：39g/L马铃薯土豆培养基PDA干粉(BD公司产品，产品目录号：633840)，余量为去离子水，115℃高压灭菌30分钟，待冷却至约60℃制备平板。
[0032]PDAS平板：39g/L马铃薯土豆培养基PDA干粉(BD公司产品，产品目录号：633840)，0.1～0.5M蔗糖，余量为去离子水，115℃高压灭菌30分钟，待冷却至约60℃制备平板。
[0033]种子培养基：5～30g/L甘露醇，5～20g/L琥珀酸，0.5～5g/L热榨黄豆饼粉，0.2～2g/L KH2PO4，0.05～0.5g/L 7H2O，余量为去离子水，用氨水调节至pH 4.0～6.0，121℃高压灭菌20分钟。
[0034]发酵培养基：60～150g/L山梨醇，15～50g/L琥珀酸，0.05～1g/L酵母抽提物，5～40g/L玉米浆干粉，0.001～0.004g/L FeSO4，0.005～0.02g/L ZnSO4，0.2～1g/L MgSO4·
7H2O，余量为去离子水,用氨水调节至pH 4.0～6.0，121℃高压灭菌20分钟。
[0035]实施例1、g5173基因打靶元件g5173
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KO1的构建
[0036]本实施方式中，来自雀稗麦角菌的FAD依赖的单加氧酶(g5173)所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0037]根据雀稗麦角菌基因组信息设计并合成如下引物：
[0038]U
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g5173
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F:5
’本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌株，所述基因工程菌株的出发菌株为雀稗麦角菌(Claviceps paspali)，其特征在于，所述基因工程菌株为将雀稗麦角菌中的FAD依赖的单加氧酶进行基因突变得到。2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因突变包括通过基因缺失、基因插入或基因取代的方式导致基因功能或活性丧失的步骤。3.一种利用权利要求1或2所述的基因工程菌株生产麦角新碱的方法，所述方法包括将所述基因工程菌株接种至培养基中进行发酵的步骤。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕雪峰，陈少欣，杨勇，张璇，杜思雨，周宇，冯磊，吴磊，黄雪年，
申请(专利权)人：浙江博崤生物制药有限公司上海医药工业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：