在单管qPCR中同时检测多种肠道致病菌的组合物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种在单管qPCR中同时检测多种肠道致病菌的组合物、试剂盒及方法，该组合物用于在单管qPCR中同时检测多种肠道致病菌。本发明专利技术可通过单管20重qPCR一次性同时检测4个菌属和5个菌种的肠道重要致病菌的共19个靶基因，检测通量大、成本低、时间短，且不需要细菌培养，适合突发腹泻疫情的应急检测。本发明专利技术的反应体系中加入了IAC内质控反应，可以有效预防假阴性结果。本发明专利技术利用qPCR方法检测的特异性好，灵敏度高，操作简便，结果也易于判读。读。读。

【技术实现步骤摘要】
在单管qPCR中同时检测多种肠道致病菌的组合物、试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及生物检测和医学诊断
，特别涉及一种在单管qPCR中同时检测多种肠道致病菌的组合物、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]肠道重要致病菌主要有金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、小肠结肠炎耶尔森菌、单细胞增生李斯特菌、致泻大肠埃希氏菌，以及沙门氏菌属、志贺氏菌属、弧菌属、弯曲杆菌属中的多数菌种等。
[0003]金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是临床院内感染最常见且最重要的一种革兰阳性菌，感染后会导致恶心、呕吐、腹泻等症状，特别是会给免疫力低下的人带来严重的健康问题。医院内金黄色葡萄球菌耐药情况也非常严重。
[0004]艰难梭菌(Clostridium difficile)为革兰阳性厌氧杆菌，可产生两种毒素：肠毒素和细胞毒素，导致肠道大量失水和出血性坏死。其引起的抗生素相关性结肠炎，是院内获得性腹泻最常见的原因；15％～25％的抗生素相关性腹泻由艰难梭菌引发。
[0005]小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)属于肠杆菌科耶尔森菌属，是一种人兽共患的肠道病原菌，是人类耶尔森氏病的主要原因，是全球范围内最重要的食源性病原菌之一。
[0006]单细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)由于致死率高，在欧盟李氏菌病被认为是最严重的食源性疾病之一。由于宿主对本菌的清除主要依靠细胞免疫功能，因此老年人、孕妇、新生儿及免疫力低下的人群易感。
[0007]致泻大肠埃希氏菌(Escherichia coli)根据致病性的不同主要包括产肠毒素性大肠埃希氏菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)、肠道侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasive E.coli，EIEC)、肠道致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenic E.coli，EPEC)、肠集聚性黏附性大肠埃希氏菌(enteroaggregative E.coli，EAEC)和肠出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagic E.coli，EHEC)5种。ETEC是发达国家旅行者腹泻的主要病原菌之一，也是小儿腹泻的重要病原菌，其发病率仅次于轮状病毒。EIEC临床表现类似菌痢，主要侵犯儿童和成人。EPEC是婴幼儿流行性腹泻的重要病原菌，在医院中常引起暴发流行。EAEC引起的成年人中毒症状表现为中度腹泻，病程1～2天；婴幼儿多表现为2周以上的持续性腹泻。EHEC因能引起人类的出血性肠炎而得名，主要致病菌株为O157：H7；人群普遍易感，但以老人儿童为主。
[0008]沙门氏菌属(Salmonella)属于革兰氏阴性肠道杆菌，其多个菌种都是常见的食源性致病菌，如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)等。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染的食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。
[0009]志贺氏菌属(Shigella)的多个菌种均是人类细菌性痢疾的病原菌，如福氏志贺菌(Shigella flexneri)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺菌(Shigella dysentery)鲍氏志贺菌(Shigella bogdii)。在全球范围内，每年大约有1.647亿痢疾病例，导致110万人死亡。志贺菌属细菌感染长期以来一直是，并将继续是世界范围内重要的公共卫生问题。
[0010]弧菌属(Vibrio)是一类可引起肠道感染的细菌，会引发肠胃炎和霍乱等疾病。弧菌属广泛分布于自然界，尤以水中为多，有100多种。主要致病菌为霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)；前者引起霍乱，后者引起食物中毒。此外，河流弧菌(Vibrio fluvialis)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)也会引起肠道疾病。
[0011]弯曲杆菌属(Campylobacter)的多个菌种是引起人类细菌性胃肠炎的一个最主要致病因素，在美国每年有130多万感染病例。在人类疾病中最经常报告发生的为空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)。诸如海欧弯曲杆菌(Campylobacter lari)和乌普萨拉弯曲杆菌(Campylobacter upsaliensis)等其它菌种也从腹泻病人身上分离出来，但是报告出现的频次较少。
[0012]传统的基于细菌培养、分离及生化鉴定的检测方法步骤繁琐、费时费力，且通常需要几天才能获得结果，不能达到快速诊断的目的。基于免疫学的酶联免疫吸附测定(ELISA)与传统的培养方法相比更简单、快速，但其灵敏度低，且容易发生非特异性的交叉反应。基于分子生物学的方法也被广泛应用于各种病原菌的检测。DNA微阵列可以同时检测多种病原体，但是成本非常高。环介导等温扩增(LAMP)是一种简单、快速、低成本的等温扩增方法，在资源有限的地区非常有用。但它也有缺点，首先，单个靶序列的检测所需引物多于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，因此设计难度大，且难以实现多重扩增；其次，LAMP的检测灵敏度也低于PCR。PCR方法简单、快速、灵敏度高、特异性强。在常规PCR中引入特异性荧光探针升级而成的实时荧光定量PCR(quantitative real
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time PCR，qPCR)技术进一步提升了灵敏度和特异性，并且由于不需要后续的凝胶电泳步骤也大大降低了交叉污染和检测结果与样本错配的可能性。此外，多重PCR作为最重要的PCR衍生技术之一，可以在一个反应体系中同时扩增多个片段，与单重反应相比又增加了一个检测通量大的优势。但是由于单管反应中多个PCR反应之间的相互干扰和竞争，多重PCR对反应体系和反应条件的要求大大高于单重PCR，其设计与开发难度随着单管反应中所包含的PCR反应个数的增加呈指数增长。而专利技术人团队所拥有的基于核酸热力学理论的核心技术正是解决这一难题的有效手段。该技术是一个融合物理、化学、计算机和生物医学的跨学科理论分析方法，利用计算机算法模拟溶液中多重核酸的杂交来完成引物、探针及反应条件的设计，可以在最大限度保证多重PCR反应的高灵敏度和高特异性的前提下显著增加单管反应中的PCR反应个数。
[0013]现也有使用多重PCR检测肠道致病菌的方法，但是存在一些问题。专利“11种肠道致病菌核酸多重PCR检测试剂盒及其应用”(CN 105525031A)及专利“一种多重PCR肠道致病菌检测引物组、试剂盒”(CN 104531898 A)均是使用普通多重PCR结合基于毛细管电泳技术对扩增产物进行检测，操作步骤复杂，实际应用中存本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在单管qPCR中同时检测多种肠道致病菌的组合物，其特征在于，在组合物用于在单管qPCR中同时检测多种肠道致病菌，该组合物检测的的靶基因包括：金黄色葡萄球菌的nuc基因，艰难梭菌的tpi基因，小肠结肠炎耶尔森菌的lysP基因，单增李斯特菌的hlyA基因，志贺菌属的ipaH基因，沙门菌属的invA基因，弧菌属的dnaJ基因，弯曲杆菌属的cadF基因，EPEC的eae和escV基因，EHEC的stx1和stx2基因，ETEC的lt、sth和stp基因，EAEC的aggR、astA和pic基因以及EIEC的invE基因；该组合物包括：用于检测EAEC的aggR基因的正向引物：SEQ ID No.1或SEQ ID No.2，探针：SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5，反向引物：SEQ ID No.6或SEQ ID No.7；用于检测EAEC的astA基因的正向引物：SEQ ID No.8或SEQ ID No.9，探针：SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12，反向引物：SEQ ID No.13、SEQ ID No.14或SEQ ID No.15；用于检测EAEC的pic基因的正向引物：SEQ ID No.16或SEQ ID No.17，探针：SEQ ID No.18、SEQ ID No.19或SEQ ID No.20，反向引物：SEQ ID No.21、SEQ ID No.22或SEQ ID No.23；用于检测EPEC和EHEC的eae基因的正向引物：SEQ ID No.24或SEQ ID No.25，探针：SEQ ID No.26或SEQ ID No.27，反向引物：SEQ ID No.28或SEQ ID No.29；用于检测EPEC和EHEC的escV基因的正向引物：SEQ ID No.30或SEQ ID No.31，探针：SEQ ID No.32或SEQ ID No.33，反向引物：SEQ ID No.34、SEQ ID No.35；用于检测EHEC的stx1基因的正向引物：SEQ ID No.36或SEQ ID No.37，探针：SEQ ID No.38、SEQ ID No.39或SEQ ID No.40，反向引物：SEQ ID No.41或SEQ ID No.42；用于检测EHEC的stx2基因的正向引物：SEQ ID No.43或SEQ ID No.44，探针：SEQ ID No.45或SEQ ID No.46，反向引物：SEQ ID No.47或SEQ ID No.48；用于检测EIEC的invE基因的正向引物：SEQ ID No.49或SEQ ID No.50，探针：SEQ ID No.51或SEQ ID No.52，反向引物：SEQ ID No.53或SEQ ID No.54；用于检测ETEC的lt基因的正向引物：SEQ ID No.55或SEQ ID No.56，探针：SEQ ID No.57、SEQ ID No.58或SEQ ID No.59，反向引物：SEQ ID No.60、SEQ ID No.61或SEQ ID No.62；用于检测ETEC的sth基因的正向引物：SEQ ID No.63、SEQ ID No.64或SEQ ID No.65，探针：SEQ ID No.66、SEQ ID No.67或SEQ ID No.68，反向引物：SEQ ID No.69、SEQ ID No.70或SEQ ID No.71；用于检测ETEC的stp基因的正向引物：SEQ ID No.72、SEQ ID No.73或SEQ ID No.74，探针：SEQ ID No.75或SEQ ID No.76，反向引物：SEQ ID No.77或SEQ ID No.78；用于检测艰难梭菌的tpi基因的正向引物：SEQ ID No.79或SEQ ID No.80，探针：SEQ ID No.81，反向引物：SEQ ID No.82或SEQ ID No.83；用于检测单增李斯特菌的hlyA基因的正向引物：SEQ ID No.84或SEQ ID No.85，探针：SEQ ID No.86或SEQ ID No.87，反向引物：SEQ ID No.88或SEQ ID No.89；用于检测金黄色葡萄球菌的nuc基因的正向引物：SEQ ID No.90或SEQ ID No.91，探针：SEQ ID No.92或SEQ ID No.93，反向引物：SEQ ID No.94或SEQ ID No.95；
用于检测小肠结肠炎耶尔森菌的lysP基因的正向引物：SEQ ID No.96或SEQ ID No.97，探针：SEQ ID No.98或SEQ ID No.99，反向引物：SEQ ID No.100或SEQ ID No.101；用于检测志贺菌属和EIEC的ipaH基因的正向引物：SEQ ID No.102或SEQ ID No.103，探针：SEQ ID No.104、SEQ ID No.105或SEQ ID No.106，反向引物：SEQ ID No.107；用于检测沙门菌属的invA基因的正向引物：SEQ ID No.108或SEQ ID No.109，探针：SEQ ID No.110或SEQ ID No.111，反向引物：SEQ ID No.112或SEQ ID No.113；用于检测弯曲杆菌属的cadF基因的正向引物：SEQ ID No.114或SEQ ID No.115，探针：SEQ ID No.116或SEQ ID No.117，反向引物：SEQ ID No.118或SEQ ID No.119；用于检测弧菌属的dnaJ基因的正向引物：SEQ ID No.120或SEQ ID No.121，探针：SEQ ID No.122或SEQ ID No.123，反向引物：SEQ ID No.124或SEQ ID No.125。2.根据权利要求1所述的在单管qPCR中同时检测多种肠道致病菌的组合物，其特征在于，上述探针序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.81、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99、SEQ ID No.104、SEQ ID No.105、SEQ ID No.106、SEQ ID No.110、SEQ ID No.111、SEQ ID No.116、SEQ ID No.117、SEQ ID No.122和SEQ ID No.123的5
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端连接有荧光基团，3
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端连接有淬灭基团，探针在完好状态下其淬灭基团可以淬灭荧光基团发出的荧光信号，因而实时荧光定量PCR仪检测不到荧光信号；在每一个PCR循环过程中，DNA聚合酶降解探针，使得淬灭基团与荧光基团分离，因此荧光恢复，荧光基团发出荧光信号，实时荧光定量PCR仪通过检测荧光信号的强度可以对未知样品进行定量分析。3.根据权利要求2所述的在单管qPCR中同时检测多种肠道致病菌的组合物，其特征在于，该组合物包括：用于检测EAEC的aggR基因的正向引物：SEQ ID No.1，探针：SEQ ID No.4，反向引物：SEQ ID No.7；用于检测EAEC的astA基因的正向引物：SEQ ID No.9，探针：SEQ ID No.11，反向引物：SEQ ID No.15；用于检测EAEC的pic基因的正向引物：SEQ ID No.17，探针：SEQ ID No.18，反向引物：SEQ ID No.21；用于检测EPEC和EHEC的eae基因的正向引物：SEQ ID No.25，探针：SEQ ID No.27，反向引物：SEQ ID No.29；用于检测EPEC和EHEC的escV基因的正向引物：SEQ ID No.31，探针：SEQ ID No.32，反向引物：SEQ ID No.35；用于检测EHEC的stx1基因的正向引物：SEQ ID No.36，探针：SEQ ID No.38，反向引物：SEQ ID No.41；用于检测EHEC的stx2基因的正向引物：SEQ ID No.44，探针：SEQ ID No.46，反向引物：SEQ ID No.48；
用于检测EIEC的invE基因的正向引物：SEQ ID No.49，探针：SEQ ID No.51，反向引物：SEQ ID No.54；用于检测ETEC的lt基因的正向引物：SEQ ID No.55，探针：SEQ ID No.58，反向引物：SEQ ID No.61；用于检测ETEC的sth基因的正向引物：SEQ ID No.65，探针：SEQ ID No.67，反向引物：SEQ ID No.71；用于检测ETEC的stp基因的正向引物：SEQ ID No.72，探针：SEQ ID No.75，反向引物：SEQ ID No.78；用于检测艰难梭菌的tpi基因的正向引物：SEQ ID No.80，探针：SEQ ID No.81，反向引物：SEQ ID No.83；用于检测单增李斯特菌的hlyA基因的正向引物：...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾兵，陈莹，赵呈雪，张林艳，马勇，郑岷雪，
申请(专利权)人：苏州国科闻普生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：