一种基于微流控芯片的全自动核酸提取、多重聚合酶链式反应的快速检测方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种基于微流控芯片的全自动核酸提取、多重聚合酶链式反应(PCR)的快速检测方法，并对所述微流控芯片中的洗涤液、PCR扩增体系进行了优化，使得吸附于核酸纯化硅胶膜上的核酸洗涤彻底，降低了蛋白质、脂质以及盐等杂质成分含量，抑制非特异性产物的产生，增强特异性产物的扩增效率，避免假阴性结果的出现。优选地，所述微流控芯片增设出气口过滤器，净化排出的气体，有利于保护操作者的安全，并且环境友好。并且环境友好。

【技术实现步骤摘要】
一种基于微流控芯片的全自动核酸提取、多重聚合酶链式反应的快速检测方法


[0001]本专利技术属于诊断试剂领域，更具体地，本专利技术涉及一种微流控芯片方式结合多重聚合酶链式反应(PCR)技术，快速、自动化检测核酸样本的方法和试剂。

技术介绍

[0002]核酸扩增检测主要步骤包含：核酸提取、裂解、清洗、纯化、扩增、检测等，步骤较多，目前核酸检测技术是分步进行，其中核酸提取需要人工或者采用核酸提取设备完成，核酸检测则需要另外的核酸检测分析设备完成，需要仪器多，而且操作繁琐，使得核酸检测仍是需要人工参与的“精细活”，因此，需要一种全自动核酸检测的设备。
[0003]目前公开的一些核酸检测设备中主要采取离心柱法提取核酸，其基本原理是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来，然后把释放出的核酸特异地吸附在离心柱的核酸吸附膜(如硅胶膜)上，这种膜只对核酸有较强的亲和力和吸附力，对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附，因而在离心时能被甩出柱子，再通过漂洗液对离心柱进行漂洗以去除杂质，最后通过洗脱液把吸附在核酸吸附膜上的核酸洗脱下来，即可得到纯化的核酸，以用于后续的核酸扩增检测。但是这种设备和检测方法仍然存在以下缺陷：1、吸附于核酸纯化硅胶膜上的核酸洗涤不够彻底，存在蛋白质、脂质以及盐等杂质成分，导致杂质含量偏高。2、核酸检测过程容易对样本核酸造成污染，对实验室环境要求较高，操作难度大，对操作人员要求高。3、当待扩增的模板非常复杂，或引物浓度极低时，无法扩增出所有目标特异性产物，出现假阴性结果。
[0004]因此，本领域亟待一些优化的技术手段，以改变以上技术现状。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种使用微流控芯片结合多重聚合酶链式反应(PCR)快速、自动化检测样本的方法。所述方法对PCR扩增体系进行了优化，增强了特异性产物的扩增效率，抑制了非特异性产物的产生，避免了假阴性结果的出现。在优选的方式中，所述方法还对用于PCR的洗涤液进行了优化，使得吸附于核酸纯化硅胶膜上的核酸洗涤彻底，降低了蛋白质、脂质以及盐等杂质成分含量。较佳的方式中，所述微流控芯片还设置出气口过滤器，净化排出的气体，有利于保护操作者的安全，并且环境友好。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供一种使用微流控芯片进行PCR扩增的方法，所述方法包含：
[0007](1)提供微流控芯片，其包括进液腔、含有核酸吸附膜的核酸提取腔、含有预混的RT
‑
PCR反应体系的PCR扩增试剂腔、PCR反应腔；
[0008](2)将样本溶液注入所述进液腔；
[0009](3)使进液腔的样本溶液进入核酸提取腔，与核酸吸附膜接触；核酸吸附膜吸附样本溶液中的核酸；洗涤核酸吸附膜去除杂质，从核酸吸附膜洗脱核酸，得到纯化后的核酸；
[0010](4)使纯化后的核酸进入PCR扩增试剂腔，与预混的RT
‑
PCR反应体系混合；使混合液进入PCR反应腔，进行逆转录及PCR扩增；
[0011]其中，所述预混的RT
‑
PCR反应体系包括逆转录试剂、扩增试剂、PCR增强剂、引物；可选地还包括探针；所述PCR增强剂是甜菜碱和二甲基亚砜(DMSO)的组合物。
[0012]在一种或多种实施方式中，步骤(3)中，所述洗涤核酸吸附膜包括采用洗涤液I和洗涤液II洗涤；
[0013]其中，所述洗涤液I中包含：1.0M～2.5M的异硫氰酸胍；20～60％乙醇(优选为30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％乙醇)；以及，1mM～20mM的Tris
‑
HCl(优选8mM～12mM的Tris
‑
HCl，更优选10mM的Tris
‑
HCl)；较佳地，所述洗涤液I的pH值为6～7(优选是6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0mM，更优选是6.6mM)；
[0014]其中，所述洗涤液II中包含：0.001M～0.05M的Tris(优选0.01M的Tris)，和0.01M～0.5M的NaCl(优选0.1M的NaCl)，以及60～90％的乙醇(优选60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％的乙醇)；较佳地，所述洗涤液II的pH值为7～8(优选pH7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0，更优选是pH7.5)。
[0015]在一种或多种实施方式中，步骤(3)中，所述洗涤核酸吸附膜还包括采用洗涤液III洗涤；所述洗涤液III为90～100％的乙醇(优选为90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％的乙醇)。
[0016]在一种或多种实施方式中，所述微流控芯片上包括机械按压囊泡1和机械按压囊泡2，分别装有洗涤液I和洗涤液II，先通过机械按压囊泡1使洗涤液Ⅰ进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗，再通过机械按压囊泡2使洗涤液Ⅱ进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗。
[0017]在一种或多种实施方式中，所述微流控芯片上包括机械按压囊泡3，装有洗涤液III，通过机械按压囊泡3使洗涤液ⅠII进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗。
[0018]在一种或多种实施方式中，步骤(2)～(4)中，样本或含有样本的溶液在芯片上的流动或转移，通过芯片上的流通通道来实现。
[0019]在一种或多种实施方式中，较佳地，通过压力驱动所述流动或转移。
[0020]在一种或多种实施方式中，所述压力包括机械压力。
[0021]在一种或多种实施方式中，步骤(4)中，核酸与预混的RT
‑
PCR反应体系的混合可在超声作用下进行。
[0022]在一种或多种实施方式中，步骤(3)中，洗涤核酸吸附膜后，还包括：针对核酸吸附膜进行烘干处理；优选烘干的温度为60～100℃，更优选70℃；优选烘干时间为1～5min，更优选2min。
[0023]在一种或多种实施方式中，步骤(3)中，洗涤核酸吸附膜后，以洗脱液从核酸吸附膜洗脱核酸，所述洗脱液为含有0.001M～0.05M Tris(优选0.01M Tris)、pH值为7～9(优选pH值为8.5)的水溶液。
[0024]在一种或多种实施方式中，所述甜菜碱的终浓度为0.5～3M，所述DMSO的含量(体积百分比)为5～20％；优选所述甜菜碱的终浓度为1.0～2.5M(如1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0、2.2M)，更优选所述甜菜碱的终浓度为1.0～1.5M，所述DMSO的含量(体积百分比)为5～15％(如6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％)，优选所述DMSO的含量(体积百分
比)为5～10％(如6％、7％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％)。
[0025]在一种或多种实施方式中，所述的样本为来自病原体的核酸样本或含有病原体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于微流控芯片的全自动核酸提取、多重聚合酶链式反应的快速检测方法，所述方法包含：(1)提供微流控芯片，其包括进液腔、含有核酸吸附膜的核酸提取腔、含有预混的RT
‑
PCR反应体系的PCR扩增试剂腔、PCR反应腔；(2)将样本溶液注入所述进液腔；(3)使进液腔的样本溶液进入核酸提取腔，与核酸吸附膜接触；核酸吸附膜吸附样本溶液中的核酸；洗涤核酸吸附膜去除杂质，从核酸吸附膜洗脱核酸，得到纯化后的核酸；(4)使纯化后的核酸进入PCR扩增试剂腔，与预混的RT
‑
PCR反应体系混合；使混合液进入PCR反应腔，进行逆转录及PCR扩增；其中，所述预混的RT
‑
PCR反应体系包括逆转录试剂、扩增试剂、PCR增强剂、引物；可选地还包括探针；所述PCR增强剂是甜菜碱和二甲基亚砜的组合物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述洗涤核酸吸附膜包括采用洗涤液I和洗涤液II洗涤；其中，所述洗涤液I中包含：1.0M～2.5M的异硫氰酸胍；20～60％乙醇；以及，1mM～20mM的Tris
‑
HCl；较佳地，所述洗涤液I的pH值为6～7；其中，所述洗涤液II中包含：0.001M～0.05M的Tris，和0.01M～0.5M的NaCl，以及60～90％的乙醇；较佳地，所述洗涤液II的pH值为7～8；较佳地，步骤(3)中，所述洗涤核酸吸附膜还包括采用洗涤液III洗涤；所述洗涤液III为90～100％的乙醇；较佳地，所述微流控芯片上包括机械按压囊泡1和机械按压囊泡2，分别装有洗涤液I和洗涤液II，先通过机械按压囊泡1使洗涤液Ⅰ进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗，再通过机械按压囊泡2使洗涤液Ⅱ进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗；较佳地，所述微流控芯片上包括机械按压囊泡3，装有洗涤液III，通过机械按压囊泡3使洗涤液ⅠII进入核酸提取腔、对核酸吸附膜进行冲洗。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，洗涤核酸吸附膜后，还包括：针对核酸吸附膜进行烘干处理；优选烘干的温度为60～100℃，更优选70℃；优选烘干时间为1～5min，更优选2min；或步骤(3)中，洗涤核酸吸附膜后，以洗脱液从核酸吸附膜洗脱核酸，所述洗脱液为含有0.001M～0.05M Tris、pH值为7～9的水溶液。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其特征在于，所述甜菜碱的终浓度为0.5～3M，所述二甲基亚砜的含量为5～20％；优选所述甜菜碱的终浓度为1.0～2.5M，所述二甲基亚砜的含量为5～15％。5.如权利要求1
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3任一项所述的方法，其特征在于，所述的样本为来自病原体的核酸样本或含有病原体核酸的样本；可选地，所述的样本为来自病毒的核酸样本或含有病毒核酸的样本；可选地，所述病毒为腺病毒、人偏肺病毒、流感病毒A型、流感病毒B型、呼吸道合胞病毒、博卡病毒、鼻病毒、HKU1病毒、NL63病毒、SARS病毒、副流感病毒1型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、猴痘病毒；优选所述病毒为呼吸道合胞病毒A型、B型；更优选所述病毒的正向引物包含：
a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1、4、7所示的正向引物；或，b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1、4、7具有90％以上序列同一性且具有a)限定的功能的正向引物；所述病毒的反向引物包含：c)核苷酸序列如SEQ ID NO:2、5、8所示的反向引物；或，d)核苷酸序列与SEQ ID NO:2、5、8具有90％以上序列同一性且具有c)限定的功能的反向引物；所述病毒的探针包含：e)核苷酸序列如SEQ ID NO:3、6、9所示的探...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娜，方彬彬，
申请(专利权)人：币冠上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：