个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法技术

本发明专利技术公开了为解决上述技术问题，本发明专利技术提供的技术方案为：个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法，包括以下步骤：步骤一、获取肿瘤患者原发或转移病灶组织样本；步骤二、以此突变基因位点为基础，翻译其编码的包括突变位点的肽链序列；步骤三、根据患者HLA分型，进行结合能力检测，筛选较强结合能力的10

【技术实现步骤摘要】
个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法


[0001]本专利技术涉及肿瘤治疗
，具体是指个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法。

技术介绍

[0002]目前，全球恶性肿瘤发病率日趋上升，死亡率高，预后差。
[0003][0004]手术，化疗，放疗等传统治疗方法治疗效果有限，患者5年生存率仍较低。尤其是放化疗副反应大，患者生活质量差，生存率低。
[0005]生物免疫治疗越来越成为治疗肿瘤的热点，通过机体免疫系统性杀伤肿瘤细胞，是未来治疗肿瘤新的治疗方法。目前生物免疫治疗肿瘤的方法较多，包括普通的CIK细胞免疫治疗，DC疫苗治疗等，但其治疗效果并不显著，患者生存率没有得到明显提高(参考文献Giraudo L,Gammaitoni L,Cangemi M,et al.Cytokine
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induced killer cells as immunotherapy for solid tumors:current evidences and perspectives.Immunotherapy.2015)。另有以非突变肿瘤高表达蛋白刺激的免疫细胞疫苗，研究有抗肿瘤免疫反应，但由于其非特异性表达，固然有副反应存在，包括视力模糊、听力下降、皮疹等(参考文献Beatriz M.Carreno,Vincent Magrini,Michelle Becker Hapak,et al.A dendritic cell vaccine increases the breadth and diversity of melanoma neoantigen
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specific T cells.Science.2015May 15；348(6236):803
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8.)。
[0006]生物免疫治疗本质也就是主要通过机体免疫系统来杀伤肿瘤细胞，其中直接发挥作用的是杀伤性T细胞，而树突状细胞(DCs)是抗原提呈细胞(APCs)，主要功能是将抗原信息提呈给T细胞。T细胞不能直接应答未加工的蛋白，相反，它们需要辅助细胞以肽表位的呈递抗原，其中所述肽表位与MHC分子结合而呈现在细胞表面。在细胞之内内源性产生的抗原通常以I类途径呈递，且刺激细胞毒T淋巴细胞(CTL)的反应(主要是CD8+T细胞)，而外源性蛋白质在MHCII类区域内被加工，且诱导辅助T淋巴细胞(主要是CD4+T细胞)的应答。对原初始T细胞的刺激需要存在共刺激分子，其中共刺激分子作为初次免疫激活中的第二信号。APCs(例如B细胞和巨噬细胞)一般不能诱导初次应答。相反，树突状细胞从共刺激分子、粘附分子和MHCI类和MHCII类分子的组成型不可调型表达来挖掘潜能，其中所述共刺激分子、粘附分子和MHCI类和MHCII类分子对发育有效的细胞免疫是必须的。(参考文献Avigan，1999,13:51
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64)。
[0007]DCs是引发初次免疫应答和耐受性发育所必需的的APC。DCs表达对原初始T细胞群刺激所必需的MHC。DCs的造血发育是明显不同的，并且可遵循几条前体途径，而其中一些途径是与单核细胞紧密相连的(参考文献Avigan，1999,13:51
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64)。不同DC亚类具有不同的发育途径。一种DC亚类具有可在诱导对自身抗原的耐受性发挥作用的调节功能(参考文献Austyn,1998,Curr.opin.Hematol.5:3
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15)。相反，DCs或其亚类也可参与诱导对自身蛋白质的免疫应答。人们认为，某些自身免疫应答是由于微环境组织损伤导致局部DC激活，然后
与T细胞相互作用，从而引发免疫应答(参考文献Ibrahim，1995，Immunol，today.16:181
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186)。因此，DCs引发T细胞应答的能力可被用于肿瘤疫苗中(参考文献Hart et al，Sem.Hematol.36:21
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25,1999)。体外用一些肿瘤相关高表达蛋白诱导产生DCs，并输回患者体内，用作为肿瘤相对特异的T细胞诱导中的APCs(参考文献Brugger et al.Ann.N.Y.Acad.Sci.1999,872:363
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371)。动物模型已经证实，DC肿瘤疫苗使T细胞的无反应性逆转并导致接下来的抗肿瘤效应(参考文献Tarte et al.Leukemia.1999,13:653
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663；Colaco et al.Molec.Med.Today.1999,5:14
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17；Timmerman et al.Ann.Rev.Med.1999,5:507
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529；Hart etal.1999,36:21
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25；Hermans et al.N.Z.Med.J.1998,111:111
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113)。然而，肿瘤相关高表达蛋白诱导产生的DCs并不具有严格的特异性，肿瘤以外的组织细胞也表达同样的蛋白，因此，其副反应是个难题。
[0008]随着科学技术研究的不断发展，我们知道肿瘤是细胞无限制增生的结果，而细胞的生长是由基因决定的。人体内存在肿瘤基因和肿瘤抑制基因两大功能相异的基因群。肿瘤的发生就是由于肿瘤基因功能上调、肿瘤抑制基因功能受抑的结果。各种外界因素如放射线、致癌化学物、病毒等均是通过对基因的改变来诱生肿瘤的，基因的改变包括碱基突变、碱基交联、DNA断裂、DNA缺失等各种DNA损伤。基因治疗是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗，是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞，直接针对疾病的根源——异常的基因本身而发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的。基因疗法综合应用分子生物学、分子遗传学、分子病毒学、细胞生物学等学科的最新研究成果。基因疗法就是基因治疗产品进入细胞后再产生目的蛋白质或多肽，从而发挥特异的生物治疗作用。临床实验证明，基因治疗的疗效高于单纯放、化疗疗效约3倍；治疗非小细胞癌，60％的患者肿瘤完全消退或部分消退；对乳腺癌的疗效达到90％。
[0009]肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的治疗也越来越成为肿瘤学专家研究的和关注的热点，目前对于早期肺癌，仍以手术治疗为主，放化疗为辅的综合治疗方法，然而肺癌患者的5年生存率仍非常低。对于晚期肺癌患者，失去手术治疗机会，以姑息性放化疗为主，其5年生存率还不足10％。因此寻找新的治疗方法，提高肺癌患者生存率，以及生活质量称为挑战。
[0010]DC细胞疫苗是另外一种较常见的生物治疗，DC细胞俗称树突状细胞，因成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。树突状细胞(DC)是人体内抗原递呈能力最强的细胞，通常情况下人体内的DC细胞数量很少，只有在抗原递呈细胞能正常发挥抗原递本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、获取肿瘤患者原发或转移病灶组织样本，具体如下：1)阅读患者CT片，然后根据CT片显示病变的部位，选择相对舒适的体位，测量病灶的最大直径，并在相当于病变的体表穿刺点区放置定位器后，行包括病灶上下层在内的CT扫描，直径>3cm者，层厚5mm，直径<3cm者，层厚2.5mm；确定穿刺点、进针方向、角度及深度，根据病灶位置选定穿刺针的型号和长度；在穿刺点常规消毒，用2％利多卡因行局部麻醉至胸膜，保留针头，再次局部扫描确认进针深度和角度；在患者屏气时快速进针至病灶内的位置，当穿刺针尖达到预定位置后切割取材；一般切割槽内可获得(1.0
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2.0)cmx0.1cm大小的线虫样组织标本，且把针头上残余组织一起用于提取DNA；2)提取DNA具体步骤为：(a)15ml的离心管加入600μL胞核裂解液，冰上冷却；(b)冷冻胞核裂解液中加入10
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20mg新鲜或者解冻组织，小型匀浆机匀浆10秒，将裂解产物转移到1.5ml微量离心管中，﹙也可选择使用研钵或研杵研磨预先冷冻在液氮中的组织，研磨后，液氮挥发，转移大约10
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20mg基本组织到含有600μL胞核裂解液的1.5ml微量离心管中﹚；(c)65℃孵育裂解产物15
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30分钟；(d)胞核裂解产物中加入3μL核糖核酸酶溶液颠倒离心管2
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5次混合，混合物37℃孵育15
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30分钟，下步之前样本冷却至室温5分钟；(e)冷却至室温的样本，加入200μL蛋白沉淀液，高速强力涡旋振荡20秒，冰上冷却样本5分钟；(f)13000
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16000xg离心4分钟，沉淀的蛋白可形成一种致密的白色颗粒；(g)小心将含有DNA的上清转移至含有600μL室温异丙醇的1.5ml干净微量离心管，留下蛋白颗粒；(h)轻柔颠倒混合溶液直到白色线状的DNA条带形成一种可见物；(i)13000
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16000xg室温离心1分钟，DNA可形成一种肉眼可见的白色小颗粒，小心倾析出上清；(j)加入600μL室温70％的乙醇，轻柔颠倒离心管数次以洗脱DNA，13000
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16000xg室温离心1分钟；(k)用巴斯德吸管或测序移液管头小心抽吸乙醇，此时DNA颗粒非常松散，注意避免把颗粒抽吸到吸管中；(l)将离心管倒转在干净的吸水纸上，风干颗粒10
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15分钟；(m)加100μLDNA再水化液65℃孵育1小时再水化DNA，周期性轻拍离心管混合溶液，也可选择，室温或4℃过夜孵育再水化DNA；(n)DNA保存在2
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8℃；(o)...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凤娥，
申请(专利权)人：苏州蓝马医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：