一种竞争型草鱼生长乳素检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种竞争型草鱼生长乳素检测试剂盒及应用。属于生物技术领域。包括：草鱼SLα抗体、草鱼SLβ抗体、草鱼SLα蛋白标准品、草鱼SLβ蛋白标准品、SLα示踪剂、SLβ示踪剂、涂板液、清洗液、阻断液、催化液、终止液、荧光检测剂A、荧光检测剂B。本发明专利技术试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，并且成本低，所得检测数据稳定、准确。可以检测草鱼血清、垂体裂解液或培养液等样品中的生长乳素浓度，检测灵敏度可以达到0.126ng/mL，为草鱼生长乳素的研究提供了有效的检测手段。了有效的检测手段。了有效的检测手段。

【技术实现步骤摘要】
一种竞争型草鱼生长乳素检测试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种竞争型草鱼生长乳素检测试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]生长乳素(Somatolactin，SL)和生长激素(Growth Hormone，GH)、泌乳素(Prolactin，PRL)同属一个家族。SL是腺垂体分泌的一种糖蛋白激素，在酸碱平衡、免疫、生长、能量代谢、性腺成熟等方面起着重要的调节作用。SL是硬骨鱼特有的一种激素，它的表达同时受到中枢神经内分泌和外周信号的调节，在垂体中的表达量较高。SL包括SLα和SLβ两种不同的亚型，SLα几乎存在于所有的硬骨鱼中，而SLβ仅在部分硬骨鱼中被发现。SL是一种多功能的激素，在草鱼中，垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)和胰岛素样生长因子IGF1/IGF2都可以有效刺激SL的分泌和释放，从而调控机体的生长和生殖过程。SL作为一种硬骨鱼特有的激素，通过对SL的荧光定量研究分析可以为鱼类内分泌研究奠定一种基础的激素检测方法，为进一步深入阐述SL在鱼类的生长、生殖过程的具体机制提供一种良好的技术手段。
[0003]因此，提供一种竞争型草鱼生长乳素检测试剂盒是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术提供了一种竞争型草鱼生长乳素检测试剂盒及应用。
[0005]荧光免疫检测技术具有专一性强、灵敏度高、实用性好等优点，作为免疫分析法的一种，竞争型(以标记抗原的竞争型为例)的测定原理是基于未标记的抗原和标记抗原竞争结合有限的抗体而实现的免疫分析法。检测时，抗体和标记抗原的浓度是固定的。当未标记的抗原加到抗体和标记抗原的免疫混合物中后，抗原和抗体的结合使得标记抗原与抗体的免疫复合物的量减少。样品中存在的抗原越多，抗体结合的标记抗原便越少，从抗体
‑
标记抗原免疫复合物的减少或游离标记抗原的增加，可以定量测定出样品中待测抗原的含量。用已知浓度的样品制备标准曲线，未知浓度的样品则可通过与标准曲线比较得出分析结果。采用本专利技术提供的试剂盒进行草鱼血清或或垂体裂解液等样品中的SLα和SLβ检测具有较高的灵敏度和特异性，并且方法简单、高效且成本低，所得检测数据稳定、准确。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种竞争型草鱼生长乳素检测试剂盒，包括：草鱼SLα抗体、SLβ抗体、草鱼SLα蛋白标准品、草鱼SLβ蛋白标准品、SLα示踪剂、SLβ示踪剂、涂板液、清洗液、阻断液、催化液、终止液、荧光检测剂A、荧光检测剂B。
[0008]进一步的，所述草鱼SLα和SLβ抗体的制备方法：
[0009](1)将纯化的重组SLα和SLβ蛋白分别用200μLPBS稀释，再分别与弗氏佐剂按1：1体积比混匀乳化，分别对家兔进行免疫，免疫完毕后，得兔抗SLα和SLβ多克隆抗血清；
[0010](2)利用蛋白A/G纯化法分别对兔抗SLα和SLβ多克隆抗血清进行纯化获得草鱼SLα和SLβ抗体。
[0011]3.根据权利要求2所述的一种竞争型草鱼生长乳素检测试剂盒，其特征在于，所述重组SLα和SLβ蛋白的制备方法：
[0012]1)利用草鱼垂体获得cDNA，进行PCR扩增得PCR产物，双酶切得SLα和SLβ双酶切产物；
[0013]2)表达载体pET
‑
28a+的构建；
[0014]3)分别将SLα和SLβ双酶切产物与pET
‑
28a(+)表达载体进行连接，得原核表达重组质粒pET
‑
28a(+)
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SLα和pET
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28a(+)
‑
SLβ；
[0015]4)分别将原核表达重组质粒pET
‑
28a(+)
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SLα和pET
‑
28a(+)
‑
SLβ转化BL21感受态细胞，经诱导表达、纯化获得重组SLα和SLβ蛋白。
[0016]进一步的，步骤1)所述PCR扩增所用引物为：
[0017]SLα引物：
[0018]上游引物：5
’‑
CGGAATTCATGAACAGGGTTAAAGTTCT
‑3’
，如SEQ ID NO.1所示；
[0019]下游引物：5
’‑
CCGCTCGAGCTA TTAGTGGGAAAGACAACTGA
‑3’
，如SEQ ID NO.2所示；
[0020]SLβ引物：
[0021]上游引物：5
’‑
CGGAATTCATGAAGAAAACTACAGTTCT
‑3’
，如SEQ ID NO.3所示；
[0022]下游引物：5
’‑
CCGCTCGAGCTATTAGAAAAAGGAGCAATTCT
‑3’
，如SEQ ID NO.4所示；
[0023]反应程序：94℃预变性5min；接着为36个循环，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min；
[0024]反应体系：
[0025]步骤1)所述PCR产物、步骤2)所述表达载体pET
‑
28a(+)分别用限制性内切酶EcoRI和Xho I双酶切；
[0026]步骤4)所述诱导表达条件：28℃，0.5mM IPTG终浓度诱导表达8h。
[0027]进一步的，所述草鱼SLα和SLβ抗体在试剂盒储存液中的终浓度均为0.5mg/mL，检测时使用稀释缓冲液稀释5000倍。
[0028]进一步的，所述草鱼SLα和SLβ蛋白标准品的浓度为250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.6ng/mL、7.8ng/mL、3.9ng/mL、1.95ng/mL、0.975ng/mL、0.488ng/mL、0ng/mL。
[0029]进一步的，所述SLα和SLβ示踪剂的制备方法：将草鱼SLα或SLβ蛋白、生物素按200μg：200μL比例混合均匀，其中生物素含量9mM，再置于冰中2h，使用脱盐柱进行纯化。
[0030]进一步的，所述SLα和SLβ示踪剂在试剂盒储存液中的终浓度为0.15μg/mL，检测时使用稀释缓冲液稀释20000倍；
[0031]涂板液：Na2CO3：1.59mg/mL；NaHCO3：2.94mg/mL；
[0032]清洗液：Na2HPO4：1.15mg/mL；NaCl：8.0mg/mL；KH2PO4：0.2mg/mL；KCl：0.2mg/mL；Tween 20：0.5μL/mL；
[0033]阻断液：Na2HPO4：1.15mg/mL；NaCl：8.0mg/mL；KH2PO4：0.2mg/mL；KCl：0.2mg/mL；BSA：10mg/mL；Tween 20：0.5μl/mL；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种竞争型草鱼生长乳素检测试剂盒，其特征在于，包括：草鱼SLα抗体、SLβ抗体、草鱼SLα蛋白标准品、草鱼SLβ蛋白标准品、SLα示踪剂、SLβ示踪剂、涂板液、清洗液、阻断液、催化液、终止液、荧光检测剂A、荧光检测剂B。2.根据权利要求1所述的一种竞争型草鱼生长乳素检测试剂盒，其特征在于，所述草鱼SLα和SLβ抗体的制备方法：(1)将纯化的重组SLα和SLβ蛋白分别用200μLPBS稀释，再分别与弗氏佐剂按1：1体积比混匀乳化，分别对家兔进行免疫，免疫完毕后，得兔抗SLα和SLβ多克隆抗血清；(2)利用蛋白A/G纯化法分别对兔抗SLα和SLβ多克隆抗血清进行纯化获得草鱼SLα和SLβ抗体。3.根据权利要求2所述的一种竞争型草鱼生长乳素检测试剂盒，其特征在于，所述重组SLα和SLβ蛋白的制备方法：1)利用草鱼垂体获得cDNA，进行PCR扩增得PCR产物，双酶切得SLα和SLβ双酶切产物；2)表达载体pET
‑
28a+的构建；3)分别将SLα和SLβ双酶切产物与pET
‑
28a(+)表达载体进行连接，得原核表达重组质粒pET
‑
28a(+)
‑
SLα和pET
‑
28a(+)
‑
SLβ；4)分别将原核表达重组质粒pET
‑
28a(+)
‑
SLα和pET
‑
28a(+)
‑
SLβ转化BL21感受态细胞，经诱导表达、纯化获得重组SLα和SLβ蛋白。4.根据权利要求3所述的一种竞争型草鱼生长乳素检测试剂盒，其特征在于，步骤1)所述PCR扩增所用引物为：SLα引物：上游引物：5
’‑
CGGAATTCATGAACAGGGTTAAAGTTCT
‑3’
，如如SEQ ID NO.1所示；下游引物：5
’‑
CCGCTCGAGCTATTAGTGGGAAAGACAACTGA
‑3’
，如SEQ ID NO.2所示；SLβ引物：上游引物：5
’‑
CGGAATTCATGAAGAAAACTACAGTTCT
‑3’
，如SEQ ID NO.3所示；下游引物：5
’‑
CCGCTCGAGCTATTAGAAAAAGGAGCAATTCT
‑3’
，如SEQ ID NO.4所示；反应程序：94℃预变性5min；接着为36个循环，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min；反应体系：步骤1)所述PCR产物、步骤2)所述表达载体pET
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28a(+)分别用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切；步骤4)所述诱导表达条件：28℃，0.5mM IPTG终浓度诱导表达8h。5.根据权利要求1所述的一种竞争型草鱼生长乳素检测试剂盒，其特征在于，所述草鱼SLα和SLβ抗体在试剂盒储存液中的终浓度均为0.5mg/mL，检...

【专利技术属性】
技术研发人员：呼光富，蔡天宜，刘香江，欧阳雨，黄安林，殷战，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：