喜树中的CYP71BE环氧化酶的基因、载体、微粒体蛋白以及应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，本发明专利技术提供了喜树中的CYP71BE环氧化酶基因和所述基因编码的相应蛋白，还提供包含本发明专利技术所述基因的质粒及包含所述表达质粒的酿酒酵母WAT11宿主细胞，并利用宿主细胞诱导表达CYP71BE微粒体蛋白，将其作为环氧化生物催化剂应用于异甘草素环氧化或异长春花苷内酰胺环氧化。环氧化或异长春花苷内酰胺环氧化。环氧化或异长春花苷内酰胺环氧化。

【技术实现步骤摘要】
喜树中的CYP71BE环氧化酶的基因、载体、微粒体蛋白以及应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及喜树中的CYP71BE环氧化酶的基因、载体、微粒体蛋白以及应用。

技术介绍

[0002]环氧化物是药物合成中一种重要的中间体，目前主要的合成方法为通过烯烃氧化制备，如利用过氧羧酸(Prilezhaev反应)、过氧单磺酸钾(史氏不对称环氧化)、叔丁基过氧化氢(Sharpless不对称环氧化)、Mn(III)salen催化剂(Jacobsen
‑
Katsuki)、双氧水或过氧化脲(Julia
‑
colonna)等氧化剂氧化烯烃。此外，在植物体内通常也存在环氧化物，它们主要由CYP71家族的蛋白氧化形成。CYP71亚家族隶属于细胞色素CYP450氧化酶系。CYP71家族基因通常参与吲哚生物碱、萜类、黄酮类成分的氧化修饰。例如从长春花中发现两条CYP71D12(P98183.2)和CYP71D351(U5HKE8.1)参与文多灵C
‑
16位的选择性羟化修饰。从长春花中发现两条CYP71D521(MG873080)和CYP71D347(MG873081)参与水甘草碱的6,7
‑
环氧化修饰。从烟草中发现CYP71D20(NP_001311564.1)参与辣椒醇生物合成过程中的马兜铃烯的羟化修饰。从薄荷中发现CYP71D13(Q9XHE7.1)和CYP71D18(AIS36970.1)分别参与柠檬烯的C
‑
3和C
‑r/>6位选择性羟化。从百里香和牛至中发现三条CYP71D(MK209616、MK209619、MK209625)参与百里香酚和香芹酚的羟化修饰。从丹参中发现两条CYP71D373和CYP71D375参与丹参酮生物合成过程中羟化环化氧化步骤。
[0003]目前，根据对成年喜树花、果、茎、叶和喜树幼苗进行靶向代谢组学分析，从喜树中发掘并鉴定了49种生物碱；根据化学反应合理性与喜树碱(CPT)生源途径，发现在喜树体内形成strictosidinic acid之后，至少还需经历分子内脱水、2,7
‑
环氧化(CYP450)、环氧化水解、2,7
‑
氧化裂解(CYP450)等十四个步骤，但对于2,7
‑
环氧化涉及CYP71家族基因的具体参与情况、喜树中CYP71BE等功能基因的发掘并不是很清楚，有待进一步的研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于结合基因组、转录组和蛋白组多组学数据进行喜树中CYP71BE基因的筛选与优选方法，进而得到喜树中的CYP71BE环氧化酶基因和所述基因编码的相应蛋白，本专利技术所述基因的质粒及包含所述表达质粒的酿酒酵母WAT11宿主细胞，同时利用宿主细胞诱导表达CYP71BE206、CYP71BE131、CYP71BE207和CYP71BE20四种CYP71BE微粒体蛋白，所述四种微粒体蛋白可用于异甘草素的选择性环氧化，同时其中CYP71BE206可用于异长春花苷内酰胺的2
‑
7位环氧化。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了喜树中的CYP71BE环氧化酶基因，包括CYP71BE206基因、CYP71BE207基因、CYP71BE208基因或CYP71BE131基因。
[0007]作为优选，所述CYP71BE206基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述
CYP71BE207基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述CYP71BE208基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述CYP71BE131基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0008]本专利技术提供了所述CYP71BE环氧化酶基因编码的蛋白，包括CYP71BE206蛋白、CYP71BE207蛋白、CYP71BE208蛋白或CYP71BE131蛋白。
[0009]作为优选，所述CYP71BE206蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CYP71BE207蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述CYP71BE208蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述CYP71BE131蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0010]本专利技术提供了含有所述CYP71BE环氧化酶基因的重组表达质粒。
[0011]作为优选，使用的原始质粒为pYES2/CT质粒。
[0012]作为优选，所述CYP71BE环氧化酶基因插入在所述原始质粒的Kpn I位点和Not I位点。
[0013]本专利技术还提供了一种表达所述CYP71BE环氧化酶基因的重组菌株，所述重组菌株以WAT11酿酒酵母为宿主菌，转化有所述的重组表达质粒。
[0014]本专利技术还提供了所述的CYP71BE环氧化酶基因编码的蛋白作为环氧化生物催化剂的应用。
[0015]作为优选，所述CYP71BE环氧化酶基因编码的蛋白的具体应用过程为：在含有反应底物、NADPH、所述CYP71BE环氧化酶基因编码的蛋白以及Tris
‑
HCl缓冲液的反应体系中进行反应，然后萃取、过滤。
[0016]作为优选，所述反应底物为异甘草素或异长春花苷；所述反应的时间为0.5
‑
8h，所述反应的温度为20
‑
40℃，所述的反应pH为6
‑
8。
[0017]作为优选，所述CYP71BE环氧化酶基因编码的蛋白用于异甘草素的选择性环氧化，所述CYP71BE206蛋白用于异长春花苷内酰胺的2
‑
7位环氧化。
[0018]通过采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：
[0019]1.本专利技术提供了四种细胞色素CYP71BE酶的氨基酸序列和编码该蛋白的核苷酸序列，包含本专利技术基因的质粒及包含本表达质粒的酿酒酵母WAT11宿主细胞；
[0020]2.利用本专利技术构建的宿主细胞可诱导表达CYP71BE环氧化酶，将四种CYP71BE微粒体蛋白(CYP71BE206、CYP71BE131、CYP71BE207和CYP71BE20)用于异甘草素的选择性环氧化，同时其中一条CYP71BE206可用于异长春花苷内酰胺的2
‑
7位环氧化。
附图说明
[0021]图1为喜树花、果、茎、叶和幼苗五个组别蛋白水平的比较分析(图1中的A为成年喜树CPT合成代谢旺盛期，图1中的B为五个组别总蛋白SDS
‑
PAGE，图1中的C为五个组别差异蛋白热图，图1中的D为五个组别蛋白主成分分析)；
[0022]图2为CaCYP71目标蛋白结构分析(图2中的A为CYP71
‑
Cac_g004916蛋白三级结构，图2中的B为CaCYP71目标蛋白与长春花中已表征CYP71多序列比对情况)；
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.喜树中的CYP71BE环氧化酶基因，其特征在于，包括CYP71BE206基因、CYP71BE207基因、CYP71BE208基因或CYP71BE131基因；所述CYP71BE206基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述CYP71BE207基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述CYP71BE208基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述CYP71BE131基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。2.权利要求1所述CYP71BE环氧化酶基因编码的蛋白，其特征在于，包括CYP71BE206蛋白、CYP71BE207蛋白、CYP71BE208蛋白或CYP71BE131蛋白；所述CYP71BE206蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CYP71BE207蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述CYP71BE208蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述CYP71BE131蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。3.含有权利要求1所述CYP71BE环氧化酶基因的重组表达质粒。4.根据权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于，使用的原始质粒为pYES2/CT质粒。5.根据权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒲祥，陈梦涵，张家华，王旻吉，林芯宇，雷明，孙萌萌，杨胜男，王晗光，黄乾明，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：