一种快速检测BCoV滴度和中和抗体的HA/HI检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于细胞工程领域，具体公开了一种快速检测BCoV滴度和中和抗体的HA/HI检测试剂盒，由以下组分组成：灭活的BCoV病毒，1mL；含0.1％小牛血清白蛋白BSA的PBS缓冲液，30mL；阳性血清对照：牛源BCoV抗体阳性血清；阴性血清对照：牛源BCoV抗体阴性血清；红细胞：1％新鲜中华仓鼠红细胞或醛化的1％中华仓鼠红细胞悬液。本发明专利技术的试剂盒使用时操作简便，节省时间，实验操作简便1小时内可出结果，为今BCoV鉴定和疫苗免疫效果评价提供了方便快捷的手段。和疫苗免疫效果评价提供了方便快捷的手段。和疫苗免疫效果评价提供了方便快捷的手段。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测BCoV滴度和中和抗体的HA/HI检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及细胞工程领域，特别是一种快速检测BCoV滴度和中和抗体的HA/HI检测试剂盒。

技术介绍

[0002]牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是20世纪70年代发现的牛腹泻病原，临床上主要表现为新生犊牛腹泻、拉血样粪便、成年牛冬季严重水样腹泻(有时伴有血和黏液)等特征。该病主要通过消化道和呼吸道传播，发病率高。一旦发病极易引起群体感染，并且诱发继发感染，给以集约化饲养为特点的养牛业造成巨大的经济损失。目前临床上主要以灭活疫苗和减毒活疫苗的防控为主，但灭活疫苗和减毒活疫苗存在生物危害性和遗传变异致使原疫苗效力丧失等问题。因此，需要对疫苗免疫效果进行评价，目前国内尚无有效的快速检测牛冠状病毒滴度和中和抗体的HA/HI检测试剂盒。

技术实现思路

[0003]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种快速检测BCoV滴度和中和抗体的HA/HI检测试剂盒，操作简便，节省时间，实验操作简便1小时内可出结果，为今BCoV鉴定和疫苗免疫效果评价提供了方便快捷的手段。
[0004]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0005]一种快速检测BCoV滴度和中和抗体的HA/HI检测试剂盒，由以下组分组成：
[0006]灭活的BCoV病毒，1mL；
[0007]含0.1％小牛血清白蛋白BSA的PBS缓冲液，30mL；
[0008]阳性血清对照：牛源BCoV抗体阳性血清；
[0009]阴性血清对照：牛源BCoV抗体阴性血清；
[0010]红细胞：1％新鲜中华仓鼠红细胞或醛化的1％中华仓鼠红细胞悬液。
[0011]进一步地，所述灭活的BCoV病毒的病毒滴度为10
8.0
TCID
50
/mL。
[0012]进一步地，所述PBS缓冲液的pH为7.2。
[0013]进一步地，所述牛源BCoV抗体阳性血清的HI价为1:64。
[0014]进一步地，所述牛源BCoV抗体阴性血清的HI价小于等于1:2。
[0015]进一步地，所述1％新鲜中华仓鼠红细胞或醛化的1％中华仓鼠红细胞悬液由以下方法获得：
[0016]1)制备中华仓鼠红细胞
[0017]采集健康成年中华仓鼠的新鲜抗凝血；然后用等量生理盐水悬浮，3000r/min离心5min，弃掉上清液及白细胞，重复3遍，获得中华仓鼠红细胞；然后用阿氏液将中华仓鼠红细胞混匀，于4℃备用；
[0018]2)中华仓鼠红细胞的醛化
[0019]取中华仓鼠红细胞离心沉淀，弃上清液，再用压积中华仓鼠红细胞10
‑
20倍体积的
生理盐水洗涤离心三次；再按0.1mL压积中华仓鼠红细胞与2.5mL pH为7.2的PBS缓冲液混合摇匀；然后边摇边滴加2.5％戊二醛0.1mL，置摇床上在室温中继续摇动60min；用pH为7.2的PBS缓冲液洗三次，再用蒸馏水洗两次；最后用0.01硫柳汞生理盐水配成10％中华仓鼠红细胞悬液，置4℃冰箱中保存备用；
[0020]3)配制1％新鲜中华仓鼠红细胞或醛化的1％中华仓鼠红细胞
[0021]取含0.1％小牛血清白蛋白BSA的PBS缓冲液9mL，加入0.1mL上述新鲜的中华仓鼠红细胞或10％中华仓鼠红细胞悬液，混合均匀，配制成1％新鲜中华仓鼠红细胞或醛化的1％中华仓鼠红细胞。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0023]1)本专利技术采用仓鼠红细胞，BCoV HA/HI实验敏感性高，特异性强，而且红细胞凝集现象容易观察效果最好；
[0024]2)本专利技术节省成本，与PCR或者ELISA等方法验相比所需试剂、材料容易获得成本低廉。
[0025]3)本专利技术节省时间，实验操作简便1小时内可出结果，节省了时间。
[0026]4)本专利技术的试剂盒使用时操作简便，不需要专业技术人员，可按照说明书操作，不需要特殊仪器设备，结果肉眼直观可见，容易判定。适合临床和实验室检测少量或者戴昂样本的检测。
[0027]5)本专利技术可替代病毒滴度测定TCID
50
和病毒中和试验，操作简便本，为今BCoV鉴定和疫苗免疫效果评价提供了方便快捷的手段。
附图说明
[0028]图1为BCoV毒株与仓鼠红细胞HA试验结果。
[0029]图2为BCoV
‑
HLJ002株的HA价与病毒滴度TCID
50
关系图。
[0030]图3为BCoV
‑
HLJ002株的HI价与中和抗体效价关系图。
具体实施方式
[0031]为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利技术，并不用于限定专利技术。
[0032]以下实施例所用毒株及血清来源：BCoV
‑
HLJ001、BCoV
‑
HLJ002、BCoV
‑
HLJ323和BCoV
‑
HLJ325株为本实验室分离鉴定保存(分离鉴定方法参照本实验室毕业硕士论文：高国强.牛冠状病毒分离鉴定及重组N蛋白间接ELISA诊断方法的建立[D].黑龙江八一农垦大学，2018)，BCoV阳性血清来自BCoV
‑
HLJ002株免疫牛制备，BCoV阴性血清采集自未吃初乳的新生犊牛。
[0033]实施例1
[0034]红细胞制备
[0035]采集健康成年鸡、小鼠、中华仓鼠、仔猪的新鲜抗凝血，用等量生理盐水悬浮，3000r/min离心5min，弃掉上清液及白细胞，重复上述步骤洗涤红细胞3遍。然后用阿氏液将红细胞混匀，于4℃备用。
[0036]红细胞的醛化
[0037]取中华仓鼠红细胞离心沉淀，弃上清液，再以相当于压积红细胞10
‑
20倍量的生理盐水洗涤离心3次。再按0.1mL压积红细胞与2.5mL pH 7.2的PBS(磷酸缓冲液)混合摇匀。然后边摇边滴加2.5％戊二醛0.1mL，置摇床上在室温中继续摇动60min。以pH 7.2PBS洗三次，再用蒸馏水洗二次。最后用0.01硫柳汞生理盐水配成10％红细胞悬液，置4℃冰箱中保存备用。
[0038]1％新鲜红细胞和醛化红细胞配制
[0039]用0.1％ BSA的PBS溶液9mL加入0.1mL上述新鲜红细胞或醛化红细胞沉淀，混合均匀，配制成1％红细胞悬液。
[0040]HA实验操作
[0041](1)在V型底96孔微量滴定板上每孔加入30μL的PBS稀释液(含0.1％BSA)，第1个孔加入30μL BCoV液，吹吸均匀后进行2倍连续稀释，即1:2、1:22、1:23、1:24、1:25……
1:2
10
最后1孔弃掉30μL病毒液，第1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测BCoV滴度和中和抗体的HA/HI检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：灭活的BCoV病毒，1mL；含0.1％小牛血清白蛋白BSA的PBS缓冲液，30mL；阳性血清对照：牛源BCoV抗体阳性血清；阴性血清对照：牛源BCoV抗体阴性血清；红细胞：1％新鲜中华仓鼠红细胞或醛化的1％中华仓鼠红细胞悬液。2.根据权利要求1所述的快速检测BCoV滴度和中和抗体的HA/HI检测试剂盒，其特征在于：所述灭活的BCoV病毒的病毒滴度为10
8.0
TCID
50
/mL。3.根据权利要求1所述的快速检测BCoV滴度和中和抗体的HA/HI检测试剂盒，其特征在于：所述PBS缓冲液的pH为7.2。4.根据权利要求1所述的快速检测BCoV滴度和中和抗体的HA/HI检测试剂盒，其特征在于：所述牛源BCoV抗体阳性血清的HI价为1:64。5.根据权利要求1所述的快速检测BCoV滴度和中和抗体的HA/HI检测试剂盒，其特征在于：所述牛源BCoV抗体阴性血清的HI价小于等于1:2。6.根据权利要求1所述的快速检测BCoV滴度和中和抗体的HA/HI检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：周玉龙，任亚超，李旭阳，白勇，戴观丽，张佳雯，赵帅，陈秋会，郭讼，孔祥鹤，伍海亮，夏立勇，张国华，高伟，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：