一种非组培枳高效毛状根转化方法技术

本发明专利技术涉及一种非组培枳高效毛状根转化方法，包括以下步骤：1.利用枳果实种子进行培养获得用于侵染的枳实生苗；2.制备供侵染所用的发根农杆菌菌液；3.将步骤1所获得的枳实生苗置于步骤2的发根农杆菌菌液中，随后在30

【技术实现步骤摘要】
一种非组培枳高效毛状根转化方法


[0001]本专利技术涉及植物毛状根转化方法
，具体涉及一种非组培枳高效毛状根转化方法。

技术介绍

[0002]毛状根是植物组织在受伤部位受到发根农杆菌的侵染时所形成的一种病理性生长，在伤口处会形成有多个分支的不定根，呈毛发状，故被称为毛状根。受到侵染后，发根农杆菌Ri质粒上的T
‑
DNA片段会插入到植物基因组中，并且T
‑
DNA片段中含有植物生长素合成基因，可以诱导植物生成带有目的基因转基因根系。毛状根具有生长速度快、不需要外源激素、遗传稳定等优点，具有很大的应用前景。
[0003]柑橘类水果是世界上产量最大的水果。柑橘作为无性繁殖的树种，枳是应用最为广泛的砧木，其具有耐寒等优良特性，但枳不耐盐碱也不抗旱，所以需要结合分子技术手段对枳进行抗性育种改良。农杆菌介导的遗传转化已经广泛的应用在柑橘上，一是使用根癌农杆菌侵染节间茎段，获得转基因阳性再生芽后使其生根获得转基因株系；二是使用发根农杆菌侵染上胚轴切口处获得转基因毛状根，这两种方法在操作时都需要保持严格的无菌环境，并且每20d左右就需要继代，继代2
‑
3次才可以获得转基因株系，不仅操作麻烦，而且耗时较长，转化效率只能达到50％左右。目前已经有多种植物具有非组培毛状根诱导培养体系，但每种植物的诱导培养体系都不同，并且同一种培养体系换一种物种就很难成功，还未有一种明确的非组培方法能够在枳上成功获得转基因毛状根。本专利技术提供了一种非组培枳高效毛状根转化方法，将目的基因转入发根农杆菌并侵染枳，转基因毛状根诱导效率可以达到90％以上。

技术实现思路

[0004]根据现有技术存在的问题，本专利技术公开了一种非组培枳高效毛状根转化方法
[0005]一种非组培枳高效毛状根转化方法，包括以下步骤：
[0006]步骤1.利用枳果实种子进行培养获得用于侵染的枳实生苗；
[0007]步骤2.制备供侵染所用的发根农杆菌菌液；
[0008]步骤3.将步骤1所获得的枳实生苗置于步骤2的发根农杆菌菌液中，随后在30
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40psi下真空渗透25min以上后转入含有蛭石基质的透气且保湿的培养容器中，在黑暗条件下培养3
‑
4天，随后转入16小时光照/8小时黑暗条件下交替培养，诱导发根，获得转基因毛状根。
[0009]进一步的，所述步骤1具体包括以下步骤：
[0010]步骤1.1、取新鲜的枳果实种子，清洗干净后，利用1mol/L氢氧化钠处理15min去除果胶；
[0011]步骤1.2、将种子置于30％的次氯酸钠溶液中消毒10min后置于湿润的纱布上，25
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30℃条件下暗培养几天；
[0012]步骤1.3、待种子发芽后即可转移到基质中，置于26
±
2℃的生长室16小时光照/8小时黑暗条件下至枝条出现木质化后即得到用于侵染的枳实生苗。
[0013]进一步的，所述步骤2具体包括以下步骤：
[0014]步骤2.1、将外源基因或是插入有外源基因的质粒转入发根农杆菌，并将发根农杆菌的菌液以1：200的比例接种到含抗生素的40
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50mL LB液体培养基中，在28℃和200r/min摇床条件下培养12h以上，得到备用菌液；
[0015]步骤2.2、将备用菌液在室温，4000r/min条件下离心5min，弃上清用40mL MT悬浮培养基重悬，加入50mg/L乙酰丁香酮，调整农杆菌菌液OD600在0.6
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1.0即得到供侵染所用的发根农杆菌菌液。
[0016]进一步的，所述步骤3中的培养容器为带有可调节透气孔的组培瓶。
[0017]为解决以上技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0018]本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一种非组培枳高效毛状根转化方法，具有以下优点：(1)不需要无菌环境，在非组培条件下就可以完成，操作简便；(2)所用的培养容器具有高保湿且透气的特点，在最开始浇足水，20d都不需要再浇水，不需要花费太多人力；(3)相比于传统组培条件至少需要两个月才可以获得无菌毛状根，诱导率在50％左右，本专利技术在共培养15d左右就可以看到白色愈伤，25d左右就能得到转基因阳性毛状根，并且转基因毛状根诱导效率可以达到90％以上，耗时较短。
[0019]下面结合附图和实施例对本专利技术进行详细说明。
附图说明
[0020]图1为枳枝条侵染后置于培养容器中的共培养图；
[0021]图2为共培养15d左右长出的白色愈伤图；
[0022]图3为共培养60d左右长出的毛状根在荧光场和明场下的对比图。
具体实施方式
[0023]以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0024]一种非组培枳高效毛状根转化方法，包括以下步骤：
[0025](1)获得用于侵染的实生苗：
[0026]取新鲜的枳果实种子，清洗干净后，1mol/L氢氧化钠处理15min去除果胶。之后将种子置于30％的次氯酸钠溶液中消毒10min，中间摇动数次。将种子置于湿润的纱布上，28℃暗培养几天，如图1所示，待种子发芽后即可转移到基质中，所用的培养容器是上海智羡仪器设备有限公司购买的组培瓶，由于其保湿性较好，在最开始浇足水即可，可以保持20d左右不用再浇水，置于26
±
2℃的生长室光照/黑暗交替培养(16小时光照/8小时黑暗)至枝条出现木质化后即可用于侵染；用于侵染的枳实生苗不能太嫩，需要枝条已经出现木质化后才可用于侵染，此时毛状根诱导效率较高。
[0027](2)制备带有目的基因的发根农杆菌菌液：
[0028]本专利技术所采用的发根农杆菌菌株是MSU440，由上海唯地生物技术有限公司提供。将带有GFP荧光标签的质粒转化发根农杆菌后，涂布于含相应抗生素的平板，28℃培养箱中
倒置培养2d，挑斑摇菌，PCR鉴定载体是否成功转入发根农杆菌。将质粒成功转入发根农杆菌的菌液以1：200的比例接种到含抗生素的40
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50mL LB液体培养基中，28℃、200r/min摇床培养12h左右备用。将菌液4000r/min、室温离心5min，弃上清用40mL MT悬浮培养基重悬，加入50mg/L乙酰丁香酮，用紫外分光光度计测定农杆菌菌液浓度，调整OD600到0.6
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1.0即可用于侵染。
[0029](3)转化枳：
[0030]将可用于侵染的枳枝条切下，使用注射器吸取菌液后在枝条根部戳5
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6个孔，戳孔过程中将菌液直接注射进枳枝条，随后将枝条浸入发根农杆菌菌液中，30psi下真空渗透约30min。
[0031](4)将真空渗透后的枳枝条转入含有惰性蛭石基质的透气且保湿的培养容器中，在黑暗条件下培养3
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4天，随后转入交替光下培养，诱导发根，获本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非组培枳高效毛状根转化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.利用枳果实种子进行培养获得用于侵染的枳实生苗；步骤2.制备供侵染所用的发根农杆菌菌液；步骤3.将步骤1所获得的枳实生苗置于步骤2的发根农杆菌菌液中，随后在30
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40psi下真空渗透25min以上后转入含有蛭石基质的透气且保湿的培养容器中，在黑暗条件下培养3
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4天，随后转入16小时光照/8小时黑暗条件下交替培养，诱导发根，获得转基因毛状根。2.根据权利要求1所述的非组培枳高效毛状根转化方法，其特征在于，所述步骤1具体包括以下步骤：步骤1.1、取新鲜的枳果实种子，清洗干净后，利用1mol/L氢氧化钠处理15min去除果胶；步骤1.2、将种子置于30％的次氯酸钠溶液中消毒10min后置于湿润的纱布上，25
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30℃条件下暗培养几天；步骤1.3、待种子发芽后即可转移到基质中...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘志勇，彭佳璇，樊正炎，周星星，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：