提高磁珠在反转录后的mRNA结合比例的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及基因检测领域，公开了一种提高磁珠在反转录后的mRNA结合比例的方法及其应用。本发明专利技术的提高磁珠在反转录后的mRNA结合比例的方法包括：将表面偶联有寡聚dT序列的磁珠在70

【技术实现步骤摘要】
提高磁珠在反转录后的mRNA结合比例的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种提高磁珠在反转录后的mRNA结合比例的方法、磁珠、应用、mRNA富集方法及目标基因表达水平的检测方法。

技术介绍

[0002]对于基因表达调控的研究来说，转录组测序方法能够从全基因组水平上检测细胞内几乎所有基因的表达水平；并且随着单细胞转录组测序技术的发展，研究者可以从单细胞水平检测基因的表达。然而，大部分的情况，研究者更加关注部分基因的表达情况，而非全基因组所有基因的表达情况，这就造成了测序量的“浪费”。例如，很多的临床疾病的诊断和疗效评价如传染病诊断和疗效评价、优生优育检测、肿瘤病诊断、遗传病诊断等均只需要了解数个特定基因的表达变化。
[0003]目前，用来检测特异基因表达水平常见的技术方法是RT
‑
qPCR和基于核酸探针的检测方法。RT
‑
qPCR可根据各自不同的发光机制实时检测PCR退火、延伸过程中荧光信号变化来计算PCR每个循环中产物的变化量。基于核酸探针检测基因表达的技术主要为cDNA微阵列和寡核苷酸芯片，其优势在于高通量性，在一次芯片实验中可以对成千上万个基因的表达进行并行测量。但是，这些技术用于检测基因表达时，都对用来检测的起始总RNA量要求较高(基本在100ng以上)也即要求较大样本量。此外，RT
‑
qPCR技术在检测多个基因表达水平时需要相对大量的cDNA模板且实验操作步骤相对费时费力，不适用于大批量样本的检测。
[0004]现有技术鲜有能够检测少量样本的大批量基因的技术，目前技术中都要求较高的总RNA量。但是对于一些珍贵的生物样品或稀有的细胞类型，如此大量的RNA是很难满足的。此外，目前的目标基因表达检测技术方法繁琐，无法在单容器内完成，难以实现自动化检测，当需要对样本中大批量目标基因的检测时，效率较低且成本较高。因此，亟需一种能够通过少量细胞实现对样本中大批量目标基因表达水平检测的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种磁珠预处理的方法、磁珠、应用、mRNA富集方法及目标基因表达水平的检测方法。本专利技术的磁珠在反转录后的mRNA结合比例高，用于目标基因表达水平的检测方法能够降低对样本量的要求，尤其适用于小量样本检测，并且能够获得高质量的基因表达数据，为临床上珍贵稀缺或难以获得的样品的基因表达检测提供可能性；同时，本专利技术的检测方法可以在自动化设备中完成，可以应对大批量样本的检测需求。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种提高磁珠在反转录后的mRNA结合比例的方法，所述方法包括：将表面偶联有寡聚dT序列的磁珠在70
‑
80℃下进行热处理。
[0007]本专利技术第二方面提供如前所述的方法处理得到的磁珠。
[0008]本专利技术第三方面提供一种富集mRNA的方法，所述方法包括：将如前所述的磁珠与
含有mRNA的样本接触。
[0009]本专利技术第四方面提供如前所述的方法或如前所述的磁珠或如前所述的富集mRNA的方法在基因测序中的应用。
[0010]本专利技术第五方面提供如前所述的方法或如前所述的磁珠或如前所述的富集mRNA的方法在目标基因表达水平检测中的应用。
[0011]本专利技术第六方面提供一种目标基因表达水平的检测方法，所述方法包括：
[0012](1)按照如前所述的富集mRNA的方法进行mRNA富集；
[0013](2)使步骤(1)得到的体系中的mRNA进行反转录；
[0014](3)使步骤(2)得到的体系中的反转录产物与探针进行探针杂交；
[0015](4)使步骤(3)得到的体系中的反转录产物与探针的杂交产物进行建库测序。
[0016]本专利技术第七方面提供如前所述的检测方法在自动化基因检测中的应用。
[0017]通过上述技术方案，本专利技术获得的有益效果有：
[0018](1)本专利技术的磁珠相比于未处理的磁珠，结合不稳定的寡聚dT少，反转录后mRNA结合比例高，因此本专利技术的磁珠能够富集小量样本的mRNA，并且在后续反转录的过程mRNA损失量少，增加目标基因表达检测的准确度和灵敏度；
[0019](2)样本量需求少，尤其适用于小量样本：本专利技术的目标基因表达水平的检测方法对总RNA量要求低，因此同时适用于对大量细胞或少量细胞的基因表达水平的检测，可对低至100个细胞的样品进行检测；同时，本专利技术的检测方法可以对大批量样本进行检测，也可以同时获得高质量的大批量目标基因表达数据，从而为生物学过程背后的基因表达调控机制提供可能性；
[0020](3)效率高：本专利技术的目标基因表达水平的检测方法能在1天内实现目标基因表达水平检测的目的，获得高质量的基因表达数据；
[0021](4)操作简单，可在自动化设备中完成：本专利技术的目标基因表达水平的检测方法的所有步骤均在单管里完成，所述所有步骤均可在自动化设备中完成，以应对大批量样本的检测需求；
[0022](5)样品损失低，检测灵敏度高：本专利技术的目标基因表达水平的检测方法的所有步骤均在单管里完成，即整个流程不需要转移样品，从而避免因此带来的样品损失，进而提高技术方法的灵敏度。
附图说明
[0023]图1为本专利技术的一种实施方式的流程图。
[0024]图2为实施例2和对比例1中的OligodT磁珠进行反转录后GAPDH基因的cDNA在磁珠上和反应液上清的分布比例。结果显示，采用未处理的磁珠进行反转录后，反应液上清中含有绝大部分的GAPDH基因的cDNA(对比例1)，热处理后的在磁珠上含有绝大部分GAPDH基因的cDNA(实施例2)。
[0025]图3为实施例3中不同的反转录条件进行反转录后GAPDH基因的cDNA在磁珠上和反应液上清的分布比例以及实施例2的GAPDH基因的cDNA在上清中和磁珠上的分布比例。
[0026]图4为实施例4中本专利技术的方法(DASL
‑
seq)对于10,000个HEK293细胞检测到的目标基因(ACTB、PGK1、NANOG与SOX2基因)表达水平与转录组测序文库(RNA
‑
seq data)测序检
测到的基因表达水平的比较示意图。结果显示，采用本专利技术的方法检测到的目标基因表达水平与RNA
‑
seq检测的基因表达水平呈现相对一致的趋势。
[0027]图5为实施例5中本专利技术的方法(DASL
‑
seq)对于HEK293细胞和hES细胞检测到的目标基因(COX5A、PGK1、NANOG与SOX2基因)表达水平与转录组测序文库(RNA
‑
seq data)测序检测到的基因表达水平的比较示意图。结果显示，本专利技术的方法检测到的HEK293细胞和hES细胞中各个基因的表达水平变化趋势与RNA
‑
seq检测的基因表达水平的变化趋势基本一致。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高磁珠在反转录后的mRNA结合比例的方法，其特征在于，所述方法包括：将表面偶联有寡聚dT序列的磁珠在70
‑
80℃下进行热处理。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述热处理的时间为5
‑
10min，pH值为6
‑
8；和/或，所述热处理在缓冲溶液中进行，所述缓冲溶液优选为PBSTW溶液、RT溶液中的至少一种；和/或，所述磁珠的粒径为0.1
‑
1μm；和/或，热处理前磁珠在反转录后的mRNA结合量不大于10μg mRNA/mg磁珠。3.权利要求1或2所述的方法处理得到的磁珠。4.一种富集mRNA的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求3所述的磁珠与含有mRNA的样本接触。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法包括：在接触前将细胞进行细胞裂解；和/或，所述接触时间为5
‑
20min；和/或，所述方法还包括：接触后进行磁分离，去除上清；优选的，所述细胞的个数为100
‑
20,000个；优选的，所述细胞裂解所用细胞裂解缓冲液包括：50
‑
200mM Tris
‑
HCl,pH 7.5,100
‑
500mM LiCl,0.1wt％
‑
0.5wt％十二烷基硫酸锂,1
‑
5mM EDTA,5
‑
10mM DTT；优选的，所述细胞裂解的时间为5
‑
20min；优选的，对于1,000个细胞，所述细胞裂解缓冲液的用量为20
‑
40μL。6.权利要求1或2所述的方法或权利要求3所述的磁珠或权利要求4
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秋军，王承志，
申请(专利权)人：北京镁伽机器人科技有限公司，
类型：发明
国别省市：