本发明专利技术涉及一种siRNA递送系统及其制备方法与应用。本发明专利技术的siRNA递送系统包括作为载体的外泌体和装载于外泌体囊泡内的数量众多的siRNA，通过将含有siRNA与第一培养基的第一组合物和含有脂质体Lipo3000与第二培养基的第二组合物混合，经与外泌体孵育获得内部装载有siRNA的外泌体。本发明专利技术的siRNA递送系统能够更好地被细胞内吞，能够实现siRNA向靶细胞的功能性递送。本发明专利技术的制备方法能够将siRNA高效地装载到外泌体中，且有效外泌体比例高，一方面，确保siRNA递送系统具有良好的细胞靶向递送效果、实现siRNA向靶细胞的功能性递送，另一方面，该方法制备效率高，成本可控，适于推广应用。应用。应用。
【技术实现步骤摘要】
一种siRNA递送系统及其制备方法与应用
[0001]本专利技术涉及一种siRNA递送系统及其制备方法与应用。
技术介绍
[0002]小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，也被称为沉默RNA、短干扰RNA或非编码RNA，天然存在于动植物细胞基因调控系统中。siRNA长度一般为21～25bp，是宿主细胞针对外源侵入基因所表达的双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)进行切割后生成的具有特定序列的小片段RNA，可激发与之互补的目标mRNA的沉默。siRNA作为药物发挥作用，需要克服血管屏障、实现细胞内吞及溶酶体逃逸，同时还需避免核酸酶降解。脂质体和聚合物纳米颗粒递送系统已被广泛用于提高siRNA的稳定性并改善其药代动力学特性，但存在递送效率低下、免疫原性高等问题。开发低系统毒性、高递送效率、可精准靶向的递送系统是未来siRNA药物研发的关键。
[0003]外泌体(Exosome，EV)是由细胞分泌的、直径范围50～200nm、具有双层磷脂膜的胞外囊泡结构。真核和原核生物细胞均可分泌外泌体。外泌体天然存在于哺乳动物的血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中。外泌体作为细胞间信息交流的载体，包裹来自上游细胞的蛋白质、RNA、糖类、脂类等分子，再被下游细胞内吞后实现对接收细胞的刺激和调节。外泌体的纳米尺度、低免疫原性、可携带多种生物活性分子的特点使其具有成为天然药物、药物载体、诊断工具的潜力，吸引了众多药企和生物技术公司的热情投入。
[0004]利用外泌体装载siRNA进行细胞或体内递送，理论上可以克服血管屏障，逃逸细胞内溶酶体，对siRNA实现有效保护，并可通过工程化修饰实现组织靶向性，从而有效改善siRNA药物的药效和药代特性。但是，目前尚缺乏将siRNA装载到外泌体中并确保其有效敲低靶基因的方案。直接将siRNA导入外泌体，装载效率低，单个外泌体装载的siRNA的数量通常仅为个位数，难以实现功能性递送。另外，在装载siRNA进入外泌体的过程中，易对外泌体造成破坏，导致装载siRNA的有效外泌体比例下降，制备效率低下，同样制约了该技术的应用。
[0005]如何在提高单个外泌体装载siRNA的数量并确保其有效敲低靶基因的同时，提高有效外泌体的制备效率，是实现基于外泌体的siRNA递送系统功能性递送的关键。
技术实现思路
[0006]本专利技术所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的siRNA递送系统及其制备方法。
[0007]为克服现有技术不足，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种siRNA递送系统，其通过包括如下步骤的方法制备得到：
[0009]提供含有siRNA与第一培养基的第一组合物；
[0010]提供含有脂质体Lipo3000与第二培养基的第二组合物；
[0011]将所述第一组合物与第二组合物混合并添加外泌体，获得混合物；
[0012]孵育所述混合物，以获得内部装载有siRNA的外泌体。
[0013]优选地，所述孵育在30～40℃条件下进行，例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃。
[0014]进一步优选地，所述孵育采用的温度为35～40℃。
[0015]根据一些具体实施方式，所述孵育采用37℃恒温水浴的方式。
[0016]优选地，所述孵育的时间为1.5～2.5h，例如1.5h、1.8h、2h、2.2h、2.5h。
[0017]优选地，每100μL孵育体系中，含有1～5μL脂质体Lipo3000、1
×
10
‑5～10
×
10
‑5μmol siRNA以及0.1
×
10
10
～10
×
10
10
个外泌体。
[0018]进一步优选地，每100μL所述混合物中，含有1～2μL脂质体Lipo3000、4
×
10
‑5～6
×
10
‑5μmol siRNA以及1
×
10
10
～10
×
10
10
个外泌体。
[0019]优选地，所述第一培养基、第二培养基均为Opti
‑
MEM减血清培养基。
[0020]优选地，所述第一组合物中，脂质体Lipo3000的体积浓度为1％～5％；所述第二组合物中，siRNA的摩尔浓度为0.05～1.5μmol/L；所述添加的外泌体是含有外泌体的缓冲液，其中外泌体的浓度为0.1
×
10
12
个/mL及以上。在一些具体实施方式中，外泌体的浓度为0.1
×
10
12
～10
×
10
12
个/mL。
[0021]优选地，所述第一组合物、所述第二组合物和所述外泌体的投料体积之比为3～5：4～6:1。
[0022]根据一些具体实施方式，所述第一组合物和第二组合物在制备完成后，先分别静置5～10min，之后再混合。
[0023]根据本专利技术的一些具体实施方式，在孵育所述混合物后，所述脂质体Lipo3000与所述siRNA形成复合物并与所述外泌体的囊泡融合，所述外泌体以及与其融合的脂质体Lipo3000与siRNA复合物构成所述siRNA递送系统。
[0024]优选地，单个所述内部装载有siRNA的外泌体所装载的siRNA的平均个数超过10个。
[0025]进一步优选地，单个所述内部装载有siRNA的外泌体所装载的siRNA的平均个数超过50个。
[0026]更进一步优选地，单个所述内部装载有siRNA的外泌体所装载的siRNA的平均个数超过100个。再进一步优选地，单个所述内部装载有siRNA的外泌体所装载的siRNA的平均个数超过150个。
[0027]优选地，所述内部装载有siRNA的外泌体的平均颗粒大小为50～200nm。
[0028]进一步优选地，所述内部装载有siRNA的外泌体的平均颗粒大小为60～190nm。
[0029]更进一步优选地，所述内部装载有siRNA的外泌体的平均颗粒大小为70～180nm。
[0030]本专利技术还提供一种siRNA递送系统的制备方法，其包括如下步骤：
[0031]提供含有siRNA与第一培养基的第一组合物；
[0032]提供含有脂质体Lipo3000与第二培养基的第二组合物；
[0033]将所述第一组合物与第二组合物混合并添加外泌体，获得混合物；
[0034]在温度30～40℃下孵育所述混合物，控制孵育时间为1.5～2.5h，获得孵育液，所述孵育液中含有内部装载有siRNA的外泌体，所述内部装载有siRNA的外泌体的平均颗粒大小为50～200nm，且单个所述内部装载有s本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种siRNA递送系统，其特征在于：所述siRNA递送系统通过包括如下步骤的方法制备得到：提供含有siRNA与第一培养基的第一组合物；提供含有脂质体Lipo3000与第二培养基的第二组合物；将所述第一组合物与第二组合物混合并添加外泌体，获得混合物；孵育所述混合物，以获得内部装载有siRNA的外泌体。2.根据权利要求1所述的siRNA递送系统，其特征在于：所述孵育在30～40℃条件下进行；和/或，所述孵育的时间为1.5～2.5h。3.根据权利要求1所述的siRNA递送系统，其特征在于：每100μL所述混合物中，含有1～5μL脂质体Lipo3000、1
×
10
‑5～10
×
10
‑5μmol siRNA以及0.1
×
10
10
～10
×
10
10
个外泌体。4.根据权利要求1所述的siRNA递送系统，其特征在于：所述第一组合物中，脂质体Lipo3000的体积浓度为1％～5％；所述第二组合物中，siRNA的摩尔浓度为0.05～1.5μmol/L；所述添加的外泌体是含有外泌体的缓冲液，其中外泌体的浓度为0.01
×
10
12
～10
×
10
12
个/mL。5.根据权利要求1或4所述的siRNA递送系统，其特征在于：所述第一组合物、所述第二组合物和所述外泌体的投料体积之比为3～5：4～6：1。6.根据权利要求1所述的siRNA递送系统的制备方法，其特征在于：所述内部装载有siRNA的外泌体的平均颗粒大小为50～200nm，优选为60～190nm；和/或，单个所述内部装载有siRNA的外泌体所装载的siRNA的平均个数超过10个，优选超过100个，更优选超过500个，进一步优选超过1000个。7.根据权利要求1所述的siRNA递送系统，其特征在于：在孵育所述混合物后，所述脂质体Lipo3000与所述siRNA形成复合...
【专利技术属性】
技术研发人员：王程程，时青，何新军，许可，
申请(专利权)人：苏州唯思尔康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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