棘白菌素B脱酰基酶的高表达重组载体、工程菌及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种棘白菌素B脱酰基酶的高表达重组载体及基因工程菌，以及其在微生物催化制备阿尼芬净中间体——棘白菌素B母核化合物中的应用。所述高表达重组载体包括依次连接的启动子核酸序列、RBS核酸序列、编码MalE信号肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列、编码连接肽GGSGGGSG的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列、终止子。本发明专利技术的有益效果主要体现在：本发明专利技术提供了一种棘白菌素B脱酰基酶的高表达重组载体，可提高棘白菌素B脱酰基酶在大肠杆菌中的活性表达水平，通过连接肽和信号肽的筛选，使得棘白菌素B脱酰基酶能够有效且高效表达，为阿尼芬净的合成提供了新的途径。芬净的合成提供了新的途径。芬净的合成提供了新的途径。

【技术实现步骤摘要】
棘白菌素B脱酰基酶的高表达重组载体、工程菌及应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种棘白菌素B脱酰基酶的高表达重组载体及基因工程菌，以及其在微生物催化制备棘白菌素B母核化合物中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]近年来，侵袭性真菌感染问题日益严重，患者术后真菌感染的致死率高，特别是对那些免疫力低的患者，这给全球的医疗服务都带来了严重的挑战。目前。已有许多抗真菌药物被开发使用，如多烯类、三唑类、氟胞嘧啶等，但这些药物具有毒副作用大、耐药性差、临床疗效低等缺点。而棘白菌素类药物作为最新的抗真菌药物具有抗菌作用强、半衰期长、患者耐受性好等优点。其中阿尼芬净是第三代棘白菌素类药物，而生物法催化制备阿尼芬净前体已经成为国内外抗真菌药物研究的热点。
[0003]通过生物半合成法制备阿尼芬净的关键限速步骤为利用棘白菌素B(ECB)脱酰基酶对底物棘白菌素B对亚油酰基侧链进行催化水解。但是在脱酰过程中还存在很多问题，主要包括底物溶解度低和ECB脱酰基酶催化效率低。其中ECB脱酰基酶在野生菌中往往产量低、包涵体含量高、活性低的缺点。近几年来，棘白菌素B脱酰基酶的异源表达宿主主要为链霉菌，如变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌等，但其基因分子操作很不便利，可供使用的载体与改造方法也有限，而且其发酵周期与代谢调控与大肠杆菌相比复杂很多。
[0004]循环重排(Circular permutation)通过共价键连接天然蛋白质的末端，并通过现有肽键的切割引入新的末端，能够扰动局部三级结构和蛋白质动力学，并引入可能的四元结构变化，类似于融合表达，在本专利技术中通过连接肽将棘白菌素B脱酰酶的β亚基和α亚基连接起来，有利于在大肠杆菌中的高效表达。
[0005]专利文献CN 113174398 A公开了一种在大肠杆菌中用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒及应用。通过两种特定序列促溶短肽的加入，使得棘白菌素B脱酰基酶能够有效且高效表达，发酵培养得到的菌体破碎后酶活可达到57.88U/g。
[0006]在引入促溶短肽后，棘白菌素B脱酰基酶在大肠杆菌中的活性表达提高了有效提高。但是其活性和可溶性仍并不理想。大量的包涵体在周质空间内聚集，无活性的蛋白甚至对大肠杆菌的生长产生了一定的阻碍。
(三)
技术实现思路

[0007]本专利技术目的是克服现有技术中ECB脱酰基酶活性较低的不足，提供一种棘白菌素B脱酰基酶的高表达重组载体及基因工程菌，以及其在微生物催化制备棘白菌素B母核化合物中的应用。
[0008]本专利技术采用的技术方案是：
[0009]一种棘白菌素B脱酰基酶的高表达重组载体，主要包括依次连接的启动子核酸序列、RBS核酸序列、编码MalE信号肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列、编码连接肽GGSGGGSG的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列、终止子。
[0010]编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列如SEQ ID No.1所示，编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0011]编码MalE信号肽的核酸序列如SEQ ID No.5所示，编码连接肽GGSGGGSG核酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0012]构建的载体包括启动子的核酸序列如SEQ ID No.4所示。启动子可以使用常用的启动子，且可以根据所要表达的宿主来源进行选择，比如原核表达的宿主细胞中可以选择T7启动子。
[0013]本专利技术还涉及一种棘白菌素B脱酰基酶的高表达基因工程菌，由所述重组载体转化宿主菌所得。所述基因工程菌由宿主菌中转入所述重组表达载体得到。优选的，所述基因工程菌，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。重组表达载体使用的是在大肠杆菌中表达的表达载体，比如，可以使用常用的pET28a(+)载体，当然也可以使用其他载体。
[0014]本专利技术还涉及所述基因工程菌在微生物催化制备阿尼芬净中间体——棘白菌素B母核化合物中的应用。
[0015]涉及的反应式如下：
[0016][0017]具体的，所述应用为：以棘白菌素B为反应底物，以所述基因工程菌的湿菌体为生物催化剂，以尿素、氯化胆碱为助溶剂，以pH 7～8磷酸钾缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度35～45℃、搅拌速度500～800r/min的条件下进行生物催化反应制得所述棘白菌素B母核化合物。
[0018]所述湿菌体按如下方法获得：将基因工程菌接入TB培养基中，35～37℃、150～200rpm培养至OD 600达到0.8，向发酵液中加入终浓度0.1～1mM的诱导剂IPTG，转到12～28℃、150～200rpm摇床中诱导产酶，将获得的发酵液，离心收集菌体沉淀，即得所述湿菌体。所述湿菌体可进一步用0.1mM PBS缓冲液洗涤2次后重悬，菌悬液经适当倍数稀释后利用超声破碎仪破碎细胞，破碎液离心后即得到胞内粗酶液。
[0019]具体的，诱导剂IPTG添加浓度为0.2mM，添加诱导剂后转到16℃、180rpm摇床中诱导产酶16h，将获得的发酵液，离心收集菌体沉淀，即得所述湿菌体。
[0020]本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供了一种棘白菌素B脱酰基酶的高表达重组载体，可提高棘白菌素B脱酰基酶在大肠杆菌中的活性表达水平，通过连接肽和信号肽的筛选，使得棘白菌素B脱酰基酶能够有效且高效表达，为阿尼芬净的合成提供了新的途
径。
(四)附图说明
[0021]图1为与不同连接肽融合表达后酶活性与生物量结果图。
[0022]图2为与不同信号肽融合表达后酶活性与生物量结果图。
[0023]图3为表达菌株诱导剂浓度优化检测结果图。
[0024]图4为表达菌株培养温度优化检测结果图。
[0025]图5为表达菌株诱导时长优化检测结果图。
(五)具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细地说明，但本专利技术并不限于以下实施例：
[0027]LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH7.0；
[0028]TB培养基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，磷酸二氢钾2.31，磷酸氢二钾12.54，pH7.0。接种前添加卡那霉素至终浓度50ug/mL。
[0029]棘白菌素B脱酰基酶酶活测定方法：
[0030]在40℃下，在总共1mL反应混合物中测定棘白菌素B脱酰基酶活性，该混合物由pH7.0、0.1M磷酸钾缓冲液和0.2g/L ECB组成。反应在800rpm下反应30分钟。反应结束后，离心以终止反应。随后采用高效液相色谱仪检测产物生成。一个单位棘白菌素B脱酰基酶活性(U)定义为在40℃，pH7.0的标准条件下每分钟产生1ug棘白菌素B母核所需的酶量。比酶活(U/g)定义为每克干细胞所具有的活性。
[0031]实施例1：重组菌株BL21
‑
CondonPlus(DE3)pG1，pG2，pG3，pY1，pY2，pY3，pE1，pE2的构建...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种棘白菌素B脱酰基酶的高表达重组载体，主要包括依次连接的启动子核酸序列、RBS核酸序列、编码MalE信号肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列、编码连接肽GGSGGGSG的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列、终止子。2.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列如SEQ ID No.1所示，编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列如SEQ ID No.2所示。3.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于编码MalE信号肽的核酸序列如SEQ ID No.5所示，编码连接肽GGSGGGSG核酸序列如SEQ ID No.6所示。4.一种棘白菌素B脱酰基酶的高表达基因工程菌，由权利要求1所述重组载体转化宿主菌所得。5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。6.权利要求4所述基因工程菌在微生物催化制备阿尼芬净中间体——棘白菌素B母核化...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，邹树平，汤恒，牛坤，郑裕国，朱寒悦，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：