一种视网膜色素上皮细胞的扩增培养基及培养方法技术

本申请涉及一种视网膜色素上皮细胞的培养基及培养方法，具体地，本申请涉及一种含有Myosin II ATPase抑制剂的培养基，含有所述Myosin II ATPase抑制剂的试剂盒、试剂组合，以及使用所述培养基培养视网膜色素上皮细胞的方法。的方法。的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种视网膜色素上皮细胞的扩增培养基及培养方法


[0001]本申请涉及视网膜色素上皮细胞培养技术，具体涉及一种视网膜色素上皮细胞的培养基及培养方法。具体地，本申请涉及含有Myosin II ATPase抑制剂的培养基，含有所述Myosin II ATPase抑制剂的试剂盒、试剂组合，以及使用所述培养基培养视网膜色素上皮细胞的方法。

技术介绍

[0002]干性年龄相关性黄斑变性(AMD)是由视网膜色素上皮(RPE)细胞退化或者损伤引起的，是老年人致盲的主要原因之一，据不完全统计，该疾病严重影响着世界3
‑
5千万人的生活质量，且不能通过传统的药物或者手术的方法得到有效治疗。
[0003]临床研究表明RPE细胞移植是治疗AMD非常有效的手段。2012年，洛杉矶市加州大学朱尔斯
·
施泰因眼睛研究所视网膜部门主任Steven Schwartz首次将hESC诱导分化获得的RPE细胞运用于AMD的临床治疗，并取得了一定的效果，为多能性干细胞分化获得的RPE细胞的临床应用开辟了道路。2013年6月日本厚生劳动省批准了高桥雅代(Masayo Takahashi)教授利用诱导的多能性干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)开展视网膜再生临床研究的申请。高桥小组已经对首例病人进行了为期22个月的随访，部分患者的最佳矫正视力得到改善。该研究获得能使RPE细胞扩增的培养基和培养方法，也为RPE细胞的扩增和培养提供了更多的可能，也为RPE细胞的临床应用拓宽了种子资源细胞。

技术实现思路

[0004]本专利技术人经过大量创造性劳动发现，通过调整培养基成分，添加Myosin II ATPase抑制剂Blebbistatin，可显著提高视网膜色素上皮细胞的扩增效率。这为后续稳定获得高品质视网膜色素上皮细胞，实现黄斑变性等多种视网膜色素上皮细胞缺损所致疾病的细胞疗法打下基础。
[0005]培养方法
[0006]因此，在一方面，本申请提供了一种视网膜色素上皮细胞的培养方法，其包括将所述视网膜色素上皮细胞置于含有Myosin II ATPase抑制剂的培养基中进行培养的步骤；
[0007]其中，所述Myosin II ATPase抑制剂的浓度低于5.0μM。
[0008]在某些实施方案中，所述Myosin II ATPase抑制剂选自Blebbistatin、Blebbistatin衍生物(例如(S)
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(
‑
)
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Blebbistatin O
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Benzoate)，及其任意组合。
[0009]在某些实施方案中，所述Myosin II ATPase抑制剂为Blebbistatin。
[0010]在某些实施方案中，所述Myosin II ATPase抑制剂的浓度不低于0.1μM，例如，不低于0.5μM，不低于1.0μM。
[0011]在某些实施方案中，所述Myosin II ATPase抑制剂的浓度为0.1
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4.0μM(例如，0.1
‑
1.0μM、0.2
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4.0μM、0.2
‑
1.0μM、0.5
‑
4.0μM、0.5
‑
1.0μM、0.5μM、1.0μM)。
[0012]在某些实施方案中，所述Myosin II ATPase抑制剂为Blebbistatin，并且，所述
KOSR+1％的NEAA+1％的CTS
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GlutaMAX
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I。
[0033]培养基
[0034]在另一方面，本申请还提供了一种培养基，其含有Myosin II ATPase抑制剂，其中，所述Myosin II ATPase抑制剂的浓度低于5.0μM。
[0035]在某些实施方案中，所述Myosin II ATPase抑制剂的浓度不低于0.1μM，例如，不低于0.5μM，不低于1.0μM。
[0036]在某些实施方案中，所述Myosin II ATPase抑制剂的浓度为0.1
‑
4.0μM(例如，0.1
‑
1.0μM、0.2
‑
4.0μM、0.2
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1.0μM、0.5
‑
4.0μM、0.5
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1.0μM、0.5μM、1.0μM)。
[0037]在某些实施方案中，所述Myosin II ATPase抑制剂选自Blebbistatin、Blebbistatin衍生物(例如(S)
‑
(
‑
)
‑
Blebbistatin O
‑
Benzoate)，及其任意组合。
[0038]优选地，所述Myosin II ATPase抑制剂为Blebbistatin。
[0039]在某些实施方案中，所述Myosin II ATPase抑制剂为Blebbistatin，并且，所述Blebbistatin的浓度为0.1
‑
4.0μM(例如，0.1
‑
1.0μM、0.2
‑
4.0μM、0.2
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1.0μM、0.5
‑
4.0μM、0.5
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1.0μM、0.5μM、1.0μM)。
[0040]在某些实施方案中，所述培养基为适于视网膜色素上皮细胞的培养的培养基。
[0041]在某些实施方案中，所述培养基进一步包含添加了选自以下物质的基础培养基：一种或多种无血清替代物、谷氨酰胺或L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺的稳定化二肽、NEAA添加剂、KOSR，及其任意组合。
[0042]在某些实施方案中，所述基础培养基选自：KO
‑
DMEM、DMEM、DMEM/F12、Neurobasal、Neural Induction Media。
[0043]在某些实施方案中，所述培养基进一步包含添加了NEAA添加剂、KOSR和L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺的稳定化二肽的KO
‑
DMEM培养基。
[0044]在某些实施方案中，所述培养基进一步包含：70％
‑
90％的KO
‑
DMEM培养基、10％
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30％的KOSR、0.5％
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2％的NEAA以及0.5％
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2％的L
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丙氨酰
‑
L
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谷氨酰胺的稳定化二肽。
[0045]在某些实施方案中，所述培养基进一步包含：70％
‑
90％的CTS KnockOut DMEM、10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种视网膜色素上皮细胞的培养方法，其包括将所述视网膜色素上皮细胞置于含有Myosin IIATPase抑制剂的培养基中进行培养的步骤；其中，所述Myosin IIATPase抑制剂的浓度低于5.0μM。2.权利要求1所述的方法，其中，所述MyosinIIATPase抑制剂选自Blebbistatin、Blebbistatin衍生物(例如(S)
‑
(
‑
)
‑
Blebbistatin O
‑
Benzoate)，及其任意组合；优选地，所述Myosin IIATPase抑制剂为Blebbistatin。3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述MyosinIIATPase抑制剂的浓度不低于0.1μM，例如，不低于0.5μM，不低于1.0μM；优选地，所述Myosin IIATPase抑制剂的浓度为0.1
‑
4.0μM(例如，0.1
‑
1.0μM、0.2
‑
4.0μM、0.2
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1.0μM、0.5
‑
4.0μM、0.5
‑
1.0μM、0.5μM、1.0μM)。4.权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其中，所述培养基为适于视网膜色素上皮细胞的培养的培养基；优选地，所述培养基进一步包含添加了选自以下物质的基础培养基：一种或多种无血清替代物、谷氨酰胺或L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺的稳定化二肽、NEAA添加剂、KOSR，及其任意组合；优选地，所述基础培养基选自：KO
‑
DMEM、DMEM、DMEM/F12、Neurobasal、Neural Induction Media；优选地，所述培养基进一步包含添加了NEAA添加剂、KOSR和L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺的稳定化二肽的KO
‑
DMEM培养基。5.权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其中，所述培养基进一步包含EGF、bFGF和/或ROCK抑制剂(例如Y
‑
27632)。6.试剂盒，其含有MyosinIIATPase抑制剂，以及培养基；优选地，所述培养基适于视网膜色素上皮细胞的培养。7.权利要求6所述的试剂盒，其中，所述MyosinIIATPase抑制剂选自Blebbistatin、Blebbistatin衍生物(例如(S)
‑
(
‑
)
‑
Blebbistatin O
‑
Benzoate)，及其任意组合；优选地，所述Myosin IIATPase抑制剂为Blebbistatin。8.权利要求6或7所述的试剂盒，其进一步包含EGF、bFGF和/或ROCK抑制剂(例如Y
‑
27632)。9.权利要求6
‑
8任一项所述的试剂盒，其中，所述培养基为添加了选自以下物质的基础培养基：一种或多种无血清替代物、谷氨酰胺或L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺的稳定化二肽、NEAA添加剂、KOSR，及其任意组合；优选地，所述基础培养基选自：KO
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DMEM、DMEM、DMEM/F12、Neurobasal、Neural Induction Media；优选地，所述培养基为添加了NEAA添加剂、KOSR和L
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丙氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：周琪，李伟，胡宝洋，郝捷，王磊，王柳，王昱凯，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：