【技术实现步骤摘要】
一种基于双链环模板的滚环扩增方法及其应用
[0001]本专利技术属于生物
,具体涉及一种基于双链环模板的滚环扩增方法及其应用。
技术介绍
[0002]随着二代测序技术(NGS)成本的不断降低,NGS被越来越广泛地应用在临床实践当中。NGS技术相对传统PCR、qPCR和芯片技术,有着无以伦比的通量优势,即它可以一次检测大量靶标位点。
[0003]一般NGS的建库方法有扩增子法和杂交捕获法。这两种方法各有优缺点,例如扩增子法的优点是样本的投入量低(10ng及以上),实验流程短,成本也相对较低;缺点则是能检测的靶点有限,多重引物设计技术含量高。常规杂交捕获的优点则是检测的靶点多,但是探针订购成本和试剂成本都较高,实验流程复杂,样本投入量也相对扩增子法较多(100ng及以上),由于捕获产物的特异性稍弱,要求的NGS下机数据量也较多,市场上亟需成本低,流程简单的捕获技术。
[0004]滚环扩增(Rolling Cycle Amplification,RCA)是一种恒温扩增技术,不同于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,RCA无需昂贵的PCR仪器,在水浴或者金属浴条件下就能进行反应。RCA以单链环状DNA为模板,在链置换活性聚合酶的作用下,通过引物与模板环退火而进行滚环式DNA合成。RCA技术已被广泛应用于POCT和野外检测领域。例如,人体中寨卡病毒和线虫检测、食品安全检测和野外水质检测。滚环扩增产物由于会把同个靶标扩增成千上百倍线性串联体,在用于NGS建库后检 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于双链环模板的滚环扩增方法,其特征在于,所述滚环扩增方法包括如下步骤:(1)根据靶标核酸设计捕获探针,所述捕获探针分为三部分,所述捕获探针从5
’
端到3
’
端依次包括:5
’
端互补序列P
‑
lig、中间的骨架序列P
‑
bb和3
’
端互补序列P
‑
ext;所述捕获探针的5
’
端互补序列P
‑
lig和3
’
端互补序列P
‑
ext分别于靶标核酸的两端互补,所述捕获探针的骨架序列P
‑
bb不与靶标核酸互补;(2)采用捕获探针捕获靶标核酸,对捕获反应的产物进行延伸处理,所述捕获探针的3
’
端互补序列P
‑
ext沿靶标核酸进行延伸,所述靶标核酸的3
’
端沿捕获探针进行延伸,延伸结束后进行连接处理,得到双链环模板;(3)利用滚环扩增酶对双链环模板进行滚环扩增。2.根据权利要求1所述的基于双链环模板的滚环扩增方法,其特征在于,步骤(1)中,所述捕获探针的5
’
端互补序列P
‑
lig的末端碱基和靶标核酸的5
’
端的末端碱基为经过磷酸化处理的碱基。3.根据权利要求1所述的基于双链环模板的滚环扩增方法,其特征在于,步骤(1)中,所述捕获探针的长度为60
‑
90bp,所述捕获探针的GC含量为20
‑
80%,其中,5
’
端互补序列P
‑
lig和3
’
端互补序列P
‑
ext的长度各自独立的为20
‑
30bp。4.根据权利要求1所述的基于双链环模板的滚环扩增方法,其特征在于,步骤(2)中,采用捕获探针捕获靶标核酸的具体步骤包括:将捕获探针、靶标核酸与捕获缓冲液混合,于50
‑
60℃捕获反应5
‑
60min;所述捕获缓冲液中捕获探针的终浓度为0.1
‑
10pmol/μL,所述捕获缓冲液中靶标核酸的终浓度为0.05
‑
5pmol/μL;所述捕获缓冲液包括无核酸酶水、TE buffer或taq酶反...
【专利技术属性】
技术研发人员:林东旭,杨玉霞,张亚飞,
申请(专利权)人:迈杰转化医学研究苏州有限公司,
类型:发明
国别省市:
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