一种基于双链环模板的滚环扩增方法及其应用技术

技术编号:37109993 阅读:29 留言:0更新日期:2023-04-01 05:07
本发明专利技术提供了一种基于双链环模板的滚环扩增方法及其应用,所述方法包括:根据靶标核酸设计捕获探针,所述捕获探针从5

【技术实现步骤摘要】
一种基于双链环模板的滚环扩增方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
,具体涉及一种基于双链环模板的滚环扩增方法及其应用。

技术介绍

[0002]随着二代测序技术(NGS)成本的不断降低,NGS被越来越广泛地应用在临床实践当中。NGS技术相对传统PCR、qPCR和芯片技术,有着无以伦比的通量优势,即它可以一次检测大量靶标位点。
[0003]一般NGS的建库方法有扩增子法和杂交捕获法。这两种方法各有优缺点,例如扩增子法的优点是样本的投入量低(10ng及以上),实验流程短,成本也相对较低;缺点则是能检测的靶点有限,多重引物设计技术含量高。常规杂交捕获的优点则是检测的靶点多,但是探针订购成本和试剂成本都较高,实验流程复杂,样本投入量也相对扩增子法较多(100ng及以上),由于捕获产物的特异性稍弱,要求的NGS下机数据量也较多,市场上亟需成本低,流程简单的捕获技术。
[0004]滚环扩增(Rolling Cycle Amplification,RCA)是一种恒温扩增技术,不同于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,RCA无需昂贵的PCR仪器,在水浴或者金属浴条件下就能进行反应。RCA以单链环状DNA为模板,在链置换活性聚合酶的作用下,通过引物与模板环退火而进行滚环式DNA合成。RCA技术已被广泛应用于POCT和野外检测领域。例如,人体中寨卡病毒和线虫检测、食品安全检测和野外水质检测。滚环扩增产物由于会把同个靶标扩增成千上百倍线性串联体,在用于NGS建库后检测时,相比于非滚环建库产物具有高准确度、低数据重复率和低标签跳跃的数据优点。
[0005]CN113667716A公开了一种基于滚环扩增的测序文库的构建方法及其应用。该测序文库的构建方法包括:提供闭合环状的双链DNA、cDNA或RNA分子;利用特异性引物,进行滚环扩增,从而每个环仅扩增得到一条含多拷贝的单链DNA产物作为第一链;以第一链为模版,产生互补的第二链,从而获得双链DNA产物。一般滚环扩增采用的是单链环模板滚环,以单链环为模板的情况下的滚环扩增产物的产量有限。
[0006]因此,开发一种低成本、实验流程简单、扩增效率高、易于适配自动化设备的滚环扩增的技术,在核酸检测中具有重要应用价值。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足,本专利技术的目的在于提供一种基于双链环模板的滚环扩增方法及其应用。本专利技术设计了一种捕获靶标核酸后形成环状双链并结合滚环扩增的方法,所述方法的优点在于探针合成成本低,试剂成本低,扩增效率高,实验流程简单,易于适配自动化设备,可随时依据产品需求添加探针的数目,并能用滚环技术放大靶标产物。双链设计增加了可扩增的模板,可提高检测的灵敏度,同时也使探针设计更具灵活性。
[0008]为达到此专利技术目的,本专利技术采用以下技术方案:
[0009]第一方面,本专利技术提供一种基于双链环模板的滚环扩增方法,所述滚环扩增方法包括如下步骤:
[0010](1)根据靶标核酸设计捕获探针,所述捕获探针分为三部分,所述捕获探针从5

端到3

端依次包括:5

端互补序列P

lig、中间的骨架序列P

bb和3

端互补序列P

ext;所述捕获探针的5

端互补序列P

lig和3

端互补序列P

ext分别于靶标核酸的两端互补,所述捕获探针的骨架序列P

bb不与靶标核酸互补;
[0011](2)采用捕获探针捕获靶标核酸,对捕获反应的产物进行延伸处理,所述捕获探针的3

端互补序列P

ext沿靶标核酸进行延伸,所述靶标核酸的3

端沿捕获探针进行延伸,延伸结束后进行连接处理,得到双链环模板;
[0012](3)利用滚环扩增酶对双链环模板进行滚环扩增。
[0013]优选地,步骤(1)中,所述捕获探针的5

端互补序列P

lig的末端碱基和靶标核酸的5

端的末端碱基为经过磷酸化处理的碱基。
[0014]优选地,步骤(1)中,所述捕获探针的长度为60

90bp,例如可以是60bp、65bp、70bp、75bp、80bp、85bp或90bp等,所述捕获探针的GC含量为20

80%,例如可以是20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%等,其中,5

端互补序列P

lig和3

端互补序列P

ext的长度各自独立的为20

30bp,例如可以是20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp或30bp等。
[0015]优选地,步骤(2)中,采用捕获探针捕获靶标核酸的具体步骤包括:
[0016]将捕获探针、靶标核酸与捕获缓冲液混合,于50

60℃(例如可以是50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃等)捕获反应5

60min,例如可以是5min、10min、20min、30min、40min、50min或60min等;所述捕获缓冲液中捕获探针的终浓度为0.1

10pmol/μL,例如可以是0.1pmol/μL、0.5pmol/μL、1pmol/μL、2pmol/μL、3pmol/μL、4pmol/μL、5pmol/μL、6pmol/μL、7pmol/μL、8pmol/μL、9pmol/μL或10pmol/μL等,所述捕获缓冲液中靶标核酸的终浓度为0.05

5pmol/μL,例如可以是0.05pmol/μL、0.1pmol/μL、0.5pmol/μL、1pmol/μL、2pmol/μL、3pmol/μL、4pmol/μL或5pmol/μL等;所述捕获缓冲液包括无核酸酶水、TE buffer或taq酶反应缓冲液中任意一种或至少两种的组合。
[0017]优选地,步骤(2)中,所述延伸处理的具体步骤包括:
[0018]采用DNA聚合酶对捕获反应的产物进行延伸处理,所述捕获探针的3

端互补序列P

ext沿靶标核酸进行延伸,所述靶标核酸的3

端沿捕获探针进行延伸;所述延伸处理的温度为50

65℃,例如可以是50℃、52℃、54℃、55℃、56℃、58℃、60℃、62℃或65℃等,所述延伸处理的时间5

60min,例如可以是5min、10min、20min、30min、40min、50min或60min等;所本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于双链环模板的滚环扩增方法,其特征在于,所述滚环扩增方法包括如下步骤:(1)根据靶标核酸设计捕获探针,所述捕获探针分为三部分,所述捕获探针从5

端到3

端依次包括:5

端互补序列P

lig、中间的骨架序列P

bb和3

端互补序列P

ext;所述捕获探针的5

端互补序列P

lig和3

端互补序列P

ext分别于靶标核酸的两端互补,所述捕获探针的骨架序列P

bb不与靶标核酸互补;(2)采用捕获探针捕获靶标核酸,对捕获反应的产物进行延伸处理,所述捕获探针的3

端互补序列P

ext沿靶标核酸进行延伸,所述靶标核酸的3

端沿捕获探针进行延伸,延伸结束后进行连接处理,得到双链环模板;(3)利用滚环扩增酶对双链环模板进行滚环扩增。2.根据权利要求1所述的基于双链环模板的滚环扩增方法,其特征在于,步骤(1)中,所述捕获探针的5

端互补序列P

lig的末端碱基和靶标核酸的5

端的末端碱基为经过磷酸化处理的碱基。3.根据权利要求1所述的基于双链环模板的滚环扩增方法,其特征在于,步骤(1)中,所述捕获探针的长度为60

90bp,所述捕获探针的GC含量为20

80%,其中,5

端互补序列P

lig和3

端互补序列P

ext的长度各自独立的为20

30bp。4.根据权利要求1所述的基于双链环模板的滚环扩增方法,其特征在于,步骤(2)中,采用捕获探针捕获靶标核酸的具体步骤包括:将捕获探针、靶标核酸与捕获缓冲液混合,于50

60℃捕获反应5

60min;所述捕获缓冲液中捕获探针的终浓度为0.1

10pmol/μL,所述捕获缓冲液中靶标核酸的终浓度为0.05

5pmol/μL;所述捕获缓冲液包括无核酸酶水、TE buffer或taq酶反...

【专利技术属性】
技术研发人员:林东旭杨玉霞张亚飞
申请(专利权)人:迈杰转化医学研究苏州有限公司
类型:发明
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