本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一个毛竹circRNA序列及其应用。本发明专利技术所提供的PecircCDPK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术首次从毛竹中获得PecircCDPK序列并通过在拟南芥中过表达PecircCDPK序列验证了其生物学功能。PecircCDPK具有调控植物抗旱性的功能，能够为毛竹转基因研究提供有力支持，为毛竹分子育种提供有价值的候选基因。为毛竹分子育种提供有价值的候选基因。
【技术实现步骤摘要】
一个毛竹circRNA序列及其应用
[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一个毛竹circRNA序列及其应用。
技术介绍
[0002]毛竹(Phyllostachys edulis)又称楠竹、猫头竹，其生长迅速、分布广、生产潜力大，应用广泛。随着全球气候的变化，毛竹生长常常受到干旱高温等不利环境因素的影响。
[0003]环状RNAs(circular RNAs，circRNAs)是一种由5
’
端和3
’
端共价结合的新型非编码RNA。与传统线性RNA相比，circRNAs具有闭环结构和不易被核酸外切酶降解等特点，使得其长期以来被视为剪切误差，不具备任何功能。近年来，随着高通量测序技术与生物信息学的发展，circRNAs陆续被发现直接或间接参与了植物的生长发育、开花调控、对非生物胁迫响应等多个生物学过程，在毛竹笋期也已经鉴定出circRNAs参与了木质素的合成。
[0004]然而，迄今为止没有关于干旱胁迫下毛竹circRNAs的相关报道。因此，开展干旱胁迫下毛竹circRNAs的功能研究有重要意义，可为竹子的抗性育种提供新的理论依据和基因资源。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是提供PecircCDPK基因及其应用；具体地，本专利技术提供一个与毛竹干旱胁迫相关的circRNAs。
[0006]为了实现本专利技术的目的，第一方面，本专利技术提供与抗旱性相关的PecircCDPK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述PecircCDPK基因编码与植物抗旱性相关的环状RNA。
[0007]本专利技术采用如下方法验证PecircCDPK基因：
[0008](1)以培养至3个月的毛竹叶片为材料提取总RNA和DNA。总RNA进行RNase R酶处理，并反转录为cDNA。本专利技术中，毛竹总RNA和DNA的提取采用本领域常用的提取细胞总RNA和DNA的方法即可，本专利技术的实施例中总RNA采用Trizol法，DNA采用CTAB法。
[0009](2)在提取得到毛竹总RNA和DNA后，将所述总RNA进行RNase R酶处理并反转录合成cDNA。在本专利技术中，cDNA的合成采用本领域常规的cDNA合成方法即可，无其他特殊要求；本专利技术的实施例中具体可采用Takara公司的cDNA合成试剂盒进行cDNA的合成。
[0010](3)在得到cDNA和DNA之后，进行PecircCDPK基因的发散引物和收敛引物的PCR扩增验证。本专利技术中，PecircCDPK基因PCR扩增的体系优选为20μL体系，包括5
×
PrimeSTAR GXL Buffer 4.0μL，2.5mM dNTP Mix 1.6μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，cDNA/gDNA 2.0μL，PrimeSTAR GXL DNA0.2μL，ddH2O 10.0μL。PCR扩增反应程序优选为：94℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸10s，30个循环；4℃保存。
[0011]用Primer Premier 5软件设计发散引物和收敛引物分别以gDNA和cDNA(RNase R
+
)为模板验证PecircCDPK。引物序列如下：
[0012]发散上游引物：5
′‑
TTCAAGGCAATGGACACAGA
‑3′
(SEQ ID NO.5)
[0013]发散下游引物：5
′‑
AGGAGCAACTCCATGGTCAC
‑3′
(SEQ ID NO.6)
[0014]收敛上游引物：5
′‑
AGAGCCTTTCAGAGGAGGAGA
‑3′
(SEQ ID NO.7)
[0015]收敛下游引物：5
′‑
CGCCTCCATAAGATCACGAA
‑3′
(SEQ ID NO.8)。
[0016](4)PCR扩增得到目的片段后，将所述目的片段进行测序，验证PecircCDPK基因。在PCR扩增后优选对目的片段进行纯化，对于纯化的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的DNA纯化试剂盒进行即可。
[0017](5)纯化完成后，优选将所述纯化后的目的片段连接到pGEM
‑
T Easy载体，导入大肠杆菌Trans5α感受态细胞中，经菌落PCR验证为阳性克隆后进行测序。
[0018]第二方面，本专利技术提供含有上述PecircCDPK基因的生物材料所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。
[0019]第三方面，本专利技术请求保护上述PecircCDPK基因或上述的生物材料在实现以下任一项或多项中的应用：
[0020]1)调控植物抗旱性；
[0021]2)制备抗旱性植物；
[0022]3)制备植物抗旱性调控物质。
[0023]具体地，在本专利技术所提供的应用中，利用所述PecircCDPK基因或所述生物材料制备转基因植物。
[0024]更具体地，本专利技术所提供的应用中，所述植物包括拟南芥、毛竹。
[0025]第四方面，本专利技术提供一种提高植物抗旱能力的方法，包括：利用基因工程手段，在植物中过表达PecircCDPK基因；优选地，所述植物包括拟南芥、毛竹。
[0026]在本专利技术所提供的一种提高植物抗旱能力的方法中，所述过表达的方式选自以下1)～5)，或1)～5)任选的组合：
[0027]1)通过导入具有所述基因的质粒；
[0028]2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；
[0029]3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；
[0030]4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；
[0031]5)通过导入增强子。
[0032]在本专利技术所提供的方法中，采用农杆菌介导法将PecircCDPK基因转入到拟南芥植株中，获得该基因过表达的转基因拟南芥植株；
[0033]优选地，将PecircCDPK基因构建到植物表达载体pCAMBIAsuper1300
‑
GFP上，转化农杆菌，然后浸染拟南芥花序，筛选转基因拟南芥植株。
[0034]作为本专利技术的一个具体实施方式，本专利技术中，携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中。
[0035]进一步地，采用农杆菌介导法将PecircCDPK基因转入到拟南芥植株中，获得该基因过表达的转基因植株。
[0036]优选地，将PecircCDPK基因构建到植物表达载体pCAMBIAsuper1300
‑
GFP上，转化农杆菌，然后浸染拟南芥花序，筛选转基因植株。
[0037]在本专利技术的一个具体实施方式中，以植物过表达载本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.与抗旱性相关的PecircCDPK基因，其特征在于，所述PecircCDPK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.含有权利要求1所述PecircCDPK基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。3.权利要求1所述PecircCDPK基因或权利要求2所述的生物材料在实现以下任一项或多项中的应用：1)调控植物抗旱性；2)制备抗旱性植物；3)制备植物抗旱性调控物质。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用所述PecircCDPK基因或所述生物材料制备转基因植物。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥、毛竹。6.一种提高植物抗旱能力的方法，其特征在于，包括：利用基因工程手段，在植物中过表达PecircCDPK基因；优选地，所述植物包括拟南芥、毛竹。7.根据权利要求6...
【专利技术属性】
技术研发人员：李雪平，李夷骞，杨旸，
申请(专利权)人：国际竹藤中心，
类型：发明
国别省市：
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