黄瓜接种假单胞菌后内参基因筛选及应用制造技术

本发明专利技术提供黄瓜接种假单胞菌后内参基因筛选及应用。本申请发现黄瓜CACS基因在假单胞菌处理下不同时期表达稳定，可以用作内参基因，为根际促生菌假单胞菌属有益于黄瓜生长发育及逆境胁迫的生物学研究奠定方法学基础。育及逆境胁迫的生物学研究奠定方法学基础。育及逆境胁迫的生物学研究奠定方法学基础。

【技术实现步骤摘要】
黄瓜接种假单胞菌后内参基因筛选及应用


[0001]本专利技术属于植物分子生物学
，具体涉及黄瓜接种假单胞菌后内参基因筛选及应用。

技术介绍

[0002]近年来我国设施蔬菜的面积源源不断地增加，至2016年我国设施蔬菜的面积高达391.5万公顷黄瓜是目前设施生产中最为重要的蔬菜作物之一，其在我国大部分地区均有种植。由于设施栽培中存在连作障碍以及复种指数不断提高等问题，导致大量病虫害不断发生，严重影响黄瓜的生长发育以及其产品品质，降低产量。优质高抗的品种是黄瓜绿色高效生产的重要保障，而优良品种的培育离不开高效的育种技术，由于黄瓜遗传背景狭窄，在全基因组序列信息破译之前，相关分子生物学研究进展缓慢。黄瓜是植物生物学中的一个新模式物种，因为它具有许多理想的特性，包括基因数量少、雌雄基因表达多样性丰富、(短生命周期较短(从种子到种子仅需三个月的周期)以及根癌农杆菌介导的转化已经实现。黄瓜的生理生化和育种研究已有几十年的历史，利用黄瓜基因组序列进一步研究黄瓜的分子生物学已变得更加现实。
[0003]黄瓜的起源是热带潮湿的森林地带，由于其长期处于水肥充足且有机质也比较丰富的土壤和潮湿且多雨的环境中，形成了其根系比较浅、叶片比较大、喜欢湿度和温度都比较大的环境，且有较强的耐光性等特征。植物通过根系吸收水分和养分，且强大的植物根系不仅能够改良土壤的结构和成分而且可以从土壤中吸收植物生长所必须的水分和养分，植物的根系对增强土壤的抗破碎力起着重要的作用。植物根系不仅时强大的吸收器官、活跃的代谢器官和合成器官，同时也是一个分泌器官。根系分泌物对植物的生长有促进和抑制作用，早期首先观察到根际分泌物能够促进豆科植物的固氮作用，逐渐认识到根系分泌物的性质及作用。根系分泌物主要通过影响根际微生物来改善植物的生态环境，促进植物的生长，同时增加植物的抗逆性。假单胞菌属是近年来发现的一类有益的根际促生菌，研究发现该菌属能促进植物的生长发育，增加植物的生物量，促进植物的抗盐、同时也能增加植物的一些抗病性等。因此，植物促生菌很大可能是以后研究的重点，通过分子生物学手段了解其是怎么促进生物生长和抗逆的。
[0004]使用基因表达模式分析是揭示基因表达调控机制与功能的重要方法。实时荧光定量PCR(quantitative real
‑
time PCR,RT
‑
qPCR)是检测基因表达和研究基因功能的重要工具。与半定量PCR和Northern杂交相比，qRT
‑
PCR具有灵敏度高、特异性广、定量范围广等优点，目前RT
‑
qPCR已被广泛应用于基因的表达分析。但其分析结果的准确性容易受到RNA完整性、cDNA质量、引物特异性等多种因素的影响。因此，为了获得准确、可靠的基因表达结果，RT
‑
qPCR结果必需配以合适的内参基因来进行校正和标准化，以消除这些因素造成的干扰。研究发现，在不同的实验条件或组织样品中，选择参考基因的标准也不同，因此有必要筛选参考基因。目前在黄瓜生长发育和非生物胁迫表达稳定的内参基因如TUB和ACT常被选择，由于不同的实验选择不同的内参，TUB和ACT不一定适应于假单胞菌属处理下的内参基
因。因此，选择能够在根际促生菌假单胞菌属下稳定表达的内参基因是研究根际促生菌假单胞菌属促进黄瓜生长发育及抗逆的分子机制的关键。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，我们运用生物信息学及查阅文献预测筛选了13个黄瓜内参，选其在生长发育和逆境胁迫下表达相对较稳定，检测其在新泰密刺自交系品种中根部组织即全根中的表达情况，检测其在不同时期的Ct值得变化范围，观测其是否稳定；并利用geNorm法、Norm Finder法和Best Keeper法进行分析，并进一步利用RefFinde算法，对13个内参基因在根际促生菌假单胞菌属处理后在全根中的表达变化进行比较分析，筛选出特定条件下表达相对最稳定的内参基因。
[0006]一方面，本申请提供了黄瓜中假单胞菌促生长发育及逆境胁迫的内参基因，其特征在于，所述内参基因选自Csa6G484600、Csa4G000580、Csa3G358610、Csa2G139820、Csa7G009740、Csa3G653380、Csa5G608520、Csa2G036600、Csa3G902930、Csa4G089780、Csa5G642160、Csa5G175720和Csa5G608520中的一个或多个。
[0007]进一步地，所述内参基因选自Csa7G009740、Csa3G902930、Csa3G653380、Csa2G036600和Csa3G358610中的一个或多个
[0008]进一步地，所述内参基因为Csa3G902930。
[0009]另一方面，本申请提供了上述内参基因在筛选黄瓜生长发育及逆境胁迫相关基因的应用。
[0010]另一方面，本申请提供了上述内参基因在研究根际促生菌促进黄瓜生长发育和抗逆性分子生物学研究中。
[0011]进一步地，上述应用中使用荧光定量PCR方法检测所述内参基因。
[0012]进一步地，所述PCR为定性或定量PCR。
[0013]进一步地，所述根际促生菌为假单胞菌。
[0014]进一步地，使用选自SEQ ID NO.1
‑
26的引物来扩增内参基因
[0015]另一方面，本申请提供了适用根际促生菌假单胞菌属有益于黄瓜生长发育和逆境胁迫分子机制研究的内参基因的筛选方法，其中包括使用SEQ ID NO.1
‑
26的引物序列扩增Csa6G484600、Csa4G000580、Csa3G358610、Csa2G139820、Csa7G009740、Csa3G653380、Csa5G608520、Csa2G036600、Csa3G902930、Csa4G089780、Csa5G642160、Csa5G175720和Csa5G608520基因的步骤。
[0016]进一步地，所述方法包括将14龄的黄瓜幼苗在假单胞菌处理后的72小时进行取样；样品立即在液氮中冷冻，然后在
‑
80℃下储存用于RNA提取。
[0017]除各种PCR方法之外，本申请中的内参基因检测可以使用其他本领域已知的方法，包括但不限于翻译水平的免疫印迹等方法，以及融合荧光蛋白或者报告基因的直接检测方法。
[0018]本申请中基因座位号和基因名称可以交替使用，表示相同的意思，本申请中相关基因的座位号和名称之间的对应关系可参见说明书的表1部分，如Csa3G902930对应CASC。
[0019]有益效果
[0020]专利技术查阅大量的相关文献，并运用生物信息学预测，结合不同组织生长发育的表
达和非生物胁迫下的表达情况，筛选出13个候选内参基因的基础上，采用实时定量PCR检测其候选内参基因在三种假单胞菌属处理下，分析全根的表达情况，首先分析不同内参基因的Ct值得变化范围，确定13个候选内参本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.黄瓜中假单胞菌促生长发育及逆境胁迫的内参基因，其特征在于，所述内参基因选自Csa6G484600、Csa4G000580、Csa3G358610、Csa2G139820、Csa7G009740、Csa3G653380、Csa5G608520、Csa2G036600、Csa3G902930、Csa4G089780、Csa5G642160、Csa5G175720和Csa5G608520中的一个或多个。2.根据权利要求1所述的内参基因，其中所述内参基因选自Csa7G009740、Csa3G902930、Csa3G653380、Csa2G036600和Csa3G358610中的一个或多个。3.根据权利要求2所述的内参基因，其中所述内参基因为Csa3G902930。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的内参基因在筛选黄瓜生长发育及逆境胁迫相关基因的应用。5.根据权利要求1
‑
3任一项所述的内参基因在研究根际促生菌促...

【专利技术属性】
技术研发人员：田永强，王雪芸，冀婷婷，马斯，高丽红，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：