用于选择性C-末端标记的化合物和方法技术

本公开涉及用于肽的选择性C

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于选择性C
‑
末端标记的化合物和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求根据35 U.S.C.
§
119(e)的2020年1月21日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.62/964,075和2020年6月19日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.63/041,244的优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文。


[0003]本公开涉及用于肽的选择性C
‑
末端官能化的化合物和方法。在某些实施方案中，化合物具有改善的水溶性，并且适合与肽测序方法学结合使用。

技术介绍

[0004]基于阵列的平台广泛用于检测和分析生物分子(例如蛋白质和肽)的大规模并行技术中。这些平台的实例包括用于生物传感的微阵列和用于单分子测序的像素阵列。阵列通常包括单个装置表面上的一组非常小的区域，每个区域都能够独立地分析样品。这些区域可以包括对生物分子的互补功能部分具有反应性的选择性官能化的表面部分，这允许将生物分子固定在表面上。

技术实现思路

[0005]在一个方面，本公开提供了一种肽的选择性C
‑
末端官能化的方法，其包括：
[0006]a.使多种式(I)的肽或其盐与式(II)的化合物反应：
[0007]P
‑
R(CO2H)
n
[0008](I)
[0009]HX
‑
L1‑
R1[0010](II)
[0011]以获得多种式(III)的化合物：
[0012][0013]或其盐；和
[0014]b.使多种式(III)的化合物或其盐与式(IV)的化合物反应：
[0015]R2‑
L2‑
Z
[0016](IV)
[0017]以获得多种式(V)的化合物或其盐：
[0018][0019]其中m、n、P、R(CO2H)
n
、HX、X、L1、L2、R1、R2、Y和Z在本文中定义。
[0020]在另一方面，本公开提供了一种肽的选择性C
‑
末端胺官能化的方法，其包括：
[0021]a.使多种式(VI)的肽或其盐与式(VII)的化合物反应：
[0022][0023][0024]以获得多种式(VIII)的化合物或其盐：
[0025]和
[0026]b.使多种式(VIII)的化合物或其盐与式(IX)的化合物反应：
[0027]R5‑
L4‑
Z1；
[0028](IX)
[0029]以得到多种式(X)的化合物或其盐：
[0030][0031]其中P、L3、L4、R3、R4、Y1和Z1如本文所定义。
[0032]在另一方面，本公开提供了一种肽的选择性N
‑
官能化的方法，其包括使多种式(XI)的肽或其盐与式(XII)的化合物反应：
[0033][0034]其中每个P独立地是具有N
‑
末端胺的肽，
[0035][0036]所述反应在条件(a)下进行，条件(a)包含Cu
2+
和pH约为7
‑
8.5的缓冲液；以获得多种式(XIIIa)的N
‑
末端叠氮基化合物或其盐：
[0037]或者
[0038]所述反应在条件(b)下进行，条件(b)包含Cu
2+
和pH约为10
‑
11的缓冲液；以获得多种式(XIIIb)的ε
‑
叠氮基化合物或其盐：
[0039][0040]其中P如本文所定义。
[0041]在一些实施方案中，所述方法进一步包括使多种式(XIIIb)的化合物或其盐与式(XIV)的化合物反应：
[0042]R6‑
L5‑
Z2[0043](XIV)
[0044]其中R6是包含炔烃或应变烯烃的部分；L5是接头或不存在；Z2是水溶性部分；
[0045]以获得多种式(XV)的化合物或其盐：
[0046][0047]其中Y2是由与式(XIIIb)的叠氮化物部分和R6的点击反应产生的部分。
[0048]在一些方面，本公开提供了根据本文描述的任何一种方法的选择性官能化的方
法，其中所述方法包括使单个肽分子代替多个肽反应。因此，在一些实施方案中，所述方法包括根据本文描述的方法使式(I)、(VI)和(XI)中任一个的单个多肽反应。
附图说明
[0049]图1显示了代表性的C
‑
末端羧酸酯偶联程序。
[0050]图2显示了代表性的C
‑
末端羧酸酯偶联程序。
[0051]图3A
‑
D显示了代表性的C
‑
末端偶联程序。图3A显示了天冬氨酸和谷氨酸封端的肽的代表性官能化。图3B显示了赖氨酸和精氨酸封端的肽的代表性官能化。图3C显示了在赖氨酸封端的肽的官能化之前硫化物部分的示例性保护(反应1)，以及可以使用高浓度亲核试剂和偶联试剂克服的竞争性分子内环化的实例(反应2)。图3D显示了赖氨酸封端的肽的模型官能化(反应3)，以及具有内部谷氨酸和天冬氨酸残基的精氨酸封端的肽的模型官能化(反应4)。
[0052]图4显示了模型C
‑
末端赖氨酸偶联程序。
[0053]图5A
‑
C显示了与模型C
‑
末端赖氨酸偶联程序相关的数据。图5A和图5B显示了与QP126的N
‑
末端的结合事件。红色箭头表示何时添加酶(肽酶)，之后由于ClpS(ATP依赖性Clp蛋白酶接头蛋白)与不同氨基酸的结合而观察到脉冲行为的变化。图5C显示了带有加标签的粗体片段的全长CRP(C反应蛋白)序列。
[0054]图6显示了使用4
‑
硝基乙烯基磺酰胺试剂的代表性C
‑
末端赖氨酸偶联程序。
[0055]图7A
‑
B显示了与使用重氮转移化学的示例性C
‑
末端赖氨酸偶联程序相关的方案。图7A显示了位点选择性重氮转移。图7B显示了使用二肽的位点选择性重氮转移，所述二肽随后被水解。
[0056]图8显示了使用重氮转移的代表性赖氨酸偶联程序。
[0057]图9显示了肽表面固定化的代表性实例。
[0058]图10A
‑
B显示了肽测序的代表性实例。图10A显示了通过末端氨基酸识别和切割的迭代循环进行肽测序的代表性实例。图10B显示了在单一反应混合物中使用标记的氨基酸识别分子和外肽酶的动态肽测序的代表性实例。
[0059]图11显示了使用重氮转移标记胰岛素链B。
[0060]图12显示了QP101的质谱图，QP101是一种CRP肽，它是通过胰蛋白酶消化获得的肽INTIYLGGPFSPNVLNWR的叠氮基
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种肽的C
‑
末端官能化的方法，其包括：a.使多种式(I)的肽或其盐与式(II)的化合物反应：P
‑
R(CO2H)
n
(I)其中每个P独立地是肽；每个R(CO2H)
n
独立地是具有n个羧酸酯部分的氨基酸残基；和n为1或2；HX
‑
L1‑
R1(II)其中HX是能够被酰化的亲核部分；H是质子；X是杂原子；L1是接头；和R1是点击化学手柄；以获得多种式(III)的化合物：b.使多种式(III)的化合物与式(IV)的化合物反应：R2‑
L2‑
Z(IV)其中R2是与R1互补的点击化学手柄；L2是接头或不存在；和Z是水溶性部分；以得到多种式(V)的化合物：其中Y是由R1和R2的点击反应产生的部分。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种式(I)的肽是通过使蛋白质经受酶促消化以获得包含所述多种式(I)的肽的消化混合物而获得的。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述酶促消化包括切割所述蛋白质的天冬氨酸和/或谷氨酸残基的C
‑
末端键。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述酶促消化是Glu
‑
C消化。5.根据权利要求2
‑
4中任一项所述的方法，其中所述酶促消化在磷酸盐缓冲液(pH 7.8)或碳酸氢铵缓冲液(pH 4.0)中进行。6.根据权利要求2所述的方法，其中所述酶促消化包括切割所述蛋白质的赖氨酸和/或
精氨酸残基的C
‑
末端键。7.根据权利要求2所述的方法，其中所述酶促消化是胰蛋白酶+Lys
‑
C消化。8.根据权利要求2
‑
7中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的羧酸部分，如果存在的话，在酶促消化之前被保护。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述蛋白质的羧酸部分，如果存在的话，在酶促消化之前被酯化。10.根据权利要求9所述的方法，其中酯化的羧酸是甲酯。11.根据权利要求2
‑
10中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的硫化物部分在酶促消化之前被保护。12.根据权利要求11所述的方法，其中通过将所述蛋白质暴露于三(羧乙基)膦(TCEP)和碘乙酰胺(ICM)或马来酰亚胺来保护所述硫化物部分。13.根据权利要求2
‑
12中任一项所述的方法，进一步包括使所述消化混合物富集的步骤。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中n为1。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中R(CO2H)
n
是赖氨酸。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中R(CO2H)
n
是精氨酸。17.根据权利要求1
‑
13中任一项所述的方法，其中n为2。18.根据权利要求6所述的方法，其中R(CO2H)
n
是谷氨酸。19.根据权利要求6所述的方法，其中R(CO2H)
n
是天冬氨酸。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)的反应在碳二亚胺试剂存在下进行。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述碳二亚胺试剂是1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)的反应在3
‑
5范围内的pH下进行。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中HX是羟胺、胺、硫化物或醇。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中L1是取代的或未取代的脂族链，其中一个或多个碳原子任选地被杂原子、芳基、杂芳基、环烷基或杂环基部分取代。25.根据权利要求24所述的方法，其中L1是聚乙二醇(PEG)。26.根据权利要求24所述的方法，其中L1是肽。27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中R1是包含叠氮化物、四嗪、氧化腈、炔烃或应变烯烃的部分。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述应变烯烃是反式环辛烯(TCO)。29.根据权利要求27所述的方法，其中所述四嗪包含以下结构：30.根据权利要求27所述的方法，其中所述炔烃是二芳基环辛炔(DBCO)。31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中式(II)具有式(IIa)：
其中m为1
‑
25。32.根据权利要求31所述的方法，其中m为1或5。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中式(III)具有式(IIIa)：34.根据权利要求33所述的方法，其中m为1或5。35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种式(III)的化合物在步骤(b)之前富集。36.根据权利要求35所述的方法，其中纯化包括使所述多种式(III)的化合物通过G10 sephadex柱。37.根据权利要求35所述的方法，其中纯化包括使所述多种式(III)的化合物通过C18树脂柱。38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中R2是能够与R1发生点击反应的部分，包括叠氮化物、四嗪、氧化腈、炔烃或应变烯烃。39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中L2是取代的或未取代的脂族链，其中一个或多个碳原子任选地被杂原子、芳基、杂芳基、环烷基或杂环基部分取代。40.根据权利要求39所述的方法，其中L2是聚乙二醇(PEG)。41.根据权利要求1所述的方法，其中L2不存在。42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中Z包含PEG。43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中Z包含单链DNA。44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中Z进一步包含生物素(例如双生物素)。45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中式(IV)包含TCO、单链DNA和生物素(例如双生物素)。46.根据权利要求43
‑
45中任一项所述的方法，进一步包括将互补DNA链与所述单链DNA杂交的步骤。47.根据权利要求44
‑
45中任一项所述的方法，进一步包括使所述生物素(例如双生物素)与链霉亲和素结合的步骤。48.一种肽的C
‑
末端官能化的方法，其包括：a.使多种式(VI)的肽或其盐与式(VII)的化合物反应：
其中每个P独立地是肽；其中L3是接头；R3是点击化学手柄；和R4是取代的或未取代的芳基或取代的或未取代的杂芳基；以获得多种式(VIII)的化合物：b.使多种式(VIII)的化合物与式(IX)的化合物反应：R5‑
L4‑
Z
l
(IX)其中R5是与R3互补的点击化学手柄；L4是接头或不存在；和Z1是水溶性部分；以得到多种式(X)的化合物：其中Y是由R3和R5的点击反应产生的部分。49.根据权利要求48所述的方法，其中通过使蛋白质经受酶促消化以获得包含所述多种式(VI)的肽的消化混合物来获得所述多种式(VI)的肽。50.根据权利要求49所述的方法，其中所述酶促消化包括切割所述蛋白质的赖氨酸和/或精氨酸残基的C
‑
末端键。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述酶促消化使用胰蛋白酶、Lys
‑
C或其组合进行。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述酶促消化包括使所述蛋白质与胰蛋白酶和Lys
‑
C在Tris
‑
HCl缓冲液(pH 8.5)中反应。53.根据权利要求49
‑
52中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的硫化物部分在酶促消化之前被保护。54.根据权利要求53所述的方法，其中通过将所述蛋白质暴露于三(羧乙基)膦(TCEP)和碘乙酰胺(ICM)或马来酰亚胺来保护所述硫化物部分。55.根据权利要求49
‑
54中任一项所述的方法，进一步包括使所述消化混合物富集的步骤。56.根据权利要求49
‑
54中任一项所述的方法，其中所述消化混合物不经富集或纯化而用于权利要求48所述的方法中。57.根据权利要求48
‑
56中任一项所述的方法，其中步骤(a)的反应在具有约20mM
‑
500mM范围内的浓度和约9
‑
11范围内的pH的缓冲液和总体积在约20
‑
70％范围内的乙腈的存在下进行。59.根据权利要求48
‑
58中任一项所述的方法，其中步骤(a)的反应进一步包括约5...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄海冬，罗杰，
申请(专利权)人：宽腾矽公司，
类型：发明
国别省市：