用于哺乳动物体系的嵌合型别构转录因子、调控元件组和诱导表达系统技术方案

本发明专利技术涉及用于对哺乳动物细胞中感兴趣的基因进行调控的嵌合型别构转录因子以及包含所述嵌合型别构转录因子的调控元件组和诱导表达系统，所述嵌合型别构转录因子包含调控结构域以及转录激活结构域；其中，所述调控结构域选自于由RpaR、BjaR以及BraR所组成的组；所述转录激活结构域选自于P65、VP16、VP64、VTR1、VTR2以及VTR3；所述嵌合型别构转录因子以天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯作为诱导剂；所述天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯选自于由如下化合物所组成的组：对香豆酰基

【技术实现步骤摘要】
用于哺乳动物体系的嵌合型别构转录因子、调控元件组和诱导表达系统


[0001]本专利技术属于合成生物学和生物工程领域，涉及能够对哺乳动物体系中基因表达进行调控的嵌合型别构转录因子、调控元件组和诱导表达系统。具体而言，本专利技术涉及使用天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯作为诱导剂来调控宿主细胞中感兴趣基因的转录。

技术介绍

[0002]对哺乳动物宿主中基因表达的精确调控对于基因功能分析、生物制药、疫苗制备、动物模型设计以及基因治疗等均极为重要。本领域已报道了多种用于哺乳动物的基因表达调控系统，例如用免疫抑制剂或类固醇激素作为诱导剂，来调控目标基因的转录。然而，这些系统普遍存在诱导剂浓度难以控制或者对宿主基因网络造成干扰等问题。为构建与宿主基因调控网络正交的诱导表达系统，已尝试对原核细胞来源的调控元件进行改造并将其转用于真核体系，来诱导表达真核宿主中的基因。例如，可将天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)群体感应受体ScbR或始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)转录因子SpbR与单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)的真核转录激活结构域VP16融合作为转录激活因子，并将相应的操纵序列组装至CMVmini启动子5
’
端，构建以丁内酯类化合物为诱导剂的哺乳动物诱导表达系统
[1]。然而上述表达系统均为正控阻遏系统，即，在小分子存在下别构转录因子与DNA脱离。WO2007058527A2报道了将原核细胞来源的Tet调控系统转用于哺乳动物体系。在大肠杆菌中，阻遏蛋白TetR与其操纵序列tetO特异性结合抑制下游基因转录，而四环素或强力霉素(dox)与TetR的结合触发构象改变，释放启动子区，开启基因转录。对于真核宿主，可将VP16与TetR融合构建别构转录因子tTA，对包含tetO序列的真核启动子进行调控。然而，四环素或dox与tTA的结合使得该转录因子与启动子区脱离，该系统仍为正控阻遏系统。作为改进，可将TetR部分氨基酸突变，使其与诱导剂结合后与DNA结合，这种负控系统能够被较低浓度的诱导剂(例如44ng/ml强力霉素)激活。
[0003]群体感应系统是存在于细菌体内并响应菌群密度信号的系统，通过对信号分子进行合成、分泌、检测以及群体水平应答来实现细胞间通讯，从而协调群体内基因表达。该过程与生物发光、抗生素合成和菌膜形成等密切相关。不同种属的细菌分泌的信号分子在化学结构上具有差异，从而为构建与哺乳动物宿主基因调控网络正交的人工表达系统提供了更多选择。例如，变形菌的群体感应系统利用酰基高丝氨酸内酯(N
‑
acyl homoserine lactone，AHL)作为信号分子，由LuxR家族别构转录因子作为受体对信号分子的浓度信息进行转导。本领域已报道将LuxR家族别构转录因子与真核反式激活域NF
‑
κB p65或VP16融合，构建嵌合转录因子；并将操纵序列添加至CMVmini启动子，构建响应AHL的诱导型启动子
[2]‑
[3]。目前本领域已报道的此类哺乳动物诱导系统的EC50的量级均在10μM以上，且诱导剂仅限于3
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氧代
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辛酰基
‑
L
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高丝氨酸内酯(3OC8)或3
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氧代
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己酰基
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L
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高丝氨酸内酯(3OC6)；这两种直链脂肪酸型AHL的酰基侧链相似度较高，因此基于此类AHL的多通道通讯系统在信号水平和启动子水平上均存在广泛的串扰。
[0004]在本专利技术中，通过对原核生物中以天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯作为诱导剂的群体感应系统进行数据挖掘，识别相应的别构转录因子和操纵序列，并与真核转录调控系统进行整合，构建了用于哺乳动物细胞的新型诱导表达系统。

技术实现思路

[0005]在第一方面，本专利技术提供了一种用于对哺乳动物细胞中感兴趣的基因进行调控的嵌合型别构转录因子，所述嵌合型别构转录因子包含调控结构域以及转录激活结构域；其中，所述调控结构域选自于由RpaR、BjaR以及BraR所组成的组；所述转录激活结构域选自于P65、VP16、VP64、VTR1、VTR2以及VTR3；所述嵌合型别构转录因子以天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯作为诱导剂；所述天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯选自于由如下化合物所组成的组：对香豆酰基
‑
高丝氨酸内酯(pC
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HSL)、异戊酰基
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高丝氨酸内酯(IV
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HSL)以及肉桂酰基
‑
高丝氨酸内酯(Cinn
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HSL)。
[0006]在第二方面，本专利技术提供了一种以天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯作为诱导剂的调控元件组，所述天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯选自于由如下化合物所组成的组：对香豆酰基
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高丝氨酸内酯(pC
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HSL)、异戊酰基
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高丝氨酸内酯(IV
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HSL)以及肉桂酰基
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高丝氨酸内酯(Cinn
‑
HSL)；所述调控元件组包含：
[0007]嵌合型别构转录因子，所述嵌合型别构转录因子包含调控结构域以及转录激活结构域；其中，所述调控结构域选自于由RpaR、BjaR以及BraR所组成的组；所述转录激活结构域选自于P65、VP16、VP64、VTR1、VTR2以及VTR3；以及
[0008]在哺乳动物细胞中具有活性的诱导型启动子，所述诱导型启动子包含核心序列以及与所述嵌合型别构转录因子相互作用的至少一对操纵位点对。
[0009]在第三方面，本专利技术提供了一种对哺乳动物中感兴趣的基因进行诱导表达的系统，所述诱导表达系统利用天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯作为诱导剂，所述天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯选自于由如下化合物所组成的组：对香豆酰基
‑
高丝氨酸内酯(pC
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HSL)、异戊酰基
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高丝氨酸内酯(IV
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HSL)以及肉桂酰基
‑
高丝氨酸内酯(Cinn
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HSL)；所述诱导表达系统包含：
[0010]第一基因表达盒，所述第一基因表达盒包含第一启动子序列以及嵌合型别构转录因子的编码序列，其中，所述嵌合型别构转录因子包含调控结构域以及转录激活结构域；所述调控结构域选自于由RpaR、BjaR以及BraR所组成的组；所述转录激活结构域选自于P65、VP16、VP64、VTR1、VTR2以及VTR3；以及
[0011]第二基因表达盒，所述第二基因表达盒包含诱导型启动子序列以及所述感兴趣的基因的编码序列，所述诱导型启动子序列包含与所述嵌合型别构转录因子相互作用的至少一对操纵位点对。
[0012]在第四方面，本专利技术提供了第一方面所述的嵌合型别构转录因子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于对哺乳动物细胞中感兴趣的基因进行调控的嵌合型别构转录因子，所述嵌合型别构转录因子包含调控结构域以及转录激活结构域；其中，所述调控结构域选自于由RpaR、BjaR以及BraR所组成的组；所述转录激活结构域选自于P65、VP16、VP64、VTR1、VTR2以及VTR3；所述嵌合型别构转录因子以天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯作为诱导剂；所述天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯选自于由如下化合物所组成的组：对香豆酰基
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高丝氨酸内酯(pC
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HSL)、异戊酰基
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高丝氨酸内酯(IV
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HSL)以及肉桂酰基
‑
高丝氨酸内酯(Cinn
‑
HSL)。2.如权利要求1所述的嵌合型别构转录因子，其中，所述转录激活结构域为VTR3；优选地，所述调控结构域为RpaR，所述诱导剂为pC
‑
HSL或Cinn
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HSL；优选地，所述诱导剂为pC
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HSL；优选地，所述调控结构域BjaR，所述诱导剂为IV
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HSL；优选地，所述调控结构域为BraR，所述诱导剂为Cinn
‑
HSL；优选地，使用连接肽将所述调控结构域与所述转录激活结构域相连；优选地，所述连接肽的长度为20
‑
60bp；优选地，所述连接肽具有SEQ ID NO：16的序列；优选地，所述嵌合型别构转录因子进一步包含核定位信号肽，其中，所述核定位信号肽位于所述嵌合型别构转录因子的N端或C端、或位于所述调控结构域与所述转录激活结构域之间，所述核定位信号肽包含1
‑
4个核定位序列；优选地，所述核定位序列的5
’
端和3
’
端各自独立地具有5
‑
40bp的侧翼序列；优选地，所述核定位信号肽位于所述调控结构域与所述转录激活结构域之间；优选地，所述核定位信号肽包含2个核定位序列，所述核定位序列的5
’
端和3
’
端各自独立地具有5
‑
20bp的侧翼序列；优选地，所述核定位序列具有SEQ ID NO：17的序列；优选地，所述嵌合型别构转录因子进一步包含多聚化结构域，优选地，所述多聚化结构域为CarH；优选地，使用连接肽将所述调控结构域、所述多聚化结构域与所述转录激活结构域相连；优选地，所述连接肽各自具有20
‑
60bp的长度；优选地，所述连接肽具有SEQ ID NO：16的序列；优选地，所述嵌合型别构转录因子进一步包含核定位信号肽，其中，所述核定位信号肽位于所述嵌合型别构转录因子的N端或C端、或者位于所述调控结构域与所述多聚化结构域之间、或者位于所述转录激活结构域与所述多聚化结构域之间，所述核定位信号肽包含1
‑
4个核定位序列；优选地，所述核定位序列的5
’
端和3
’
端各自独立地具有5
‑
40bp的侧翼序列；优选地，所述核定位信号肽包含2个核定位序列，所述核定位序列的5
’
端和3
’
端各自独立地具有5
‑
20bp的侧翼序列；优选地，所述核定位序列具有SEQ ID NO：17的序列；优选地，所述核定位信号肽位于所述调控结构域与所述多聚化结构域之间、或者位于所述转录激活结构域与所述多聚化结构域之间；优选地，所述多聚化结构域的5
’
端和3
’
端进一步包含连接肽，优选地，所述连接肽的各自独立地具有20
‑
60bp的长度；优选地，所述连接肽具有SEQ ID NO：16的序列；优选地，所述哺乳动物细胞为人细胞；优选地，所述哺乳动物细胞为永生化细胞、原代细胞或干细胞。3.一种以天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯作为诱导剂的调控元件组，所述天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯选自于由如下化合物所组成的组：对香豆酰基
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高丝氨酸内酯(pC
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HSL)、异戊酰基
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高丝氨酸内酯(IV
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HSL)以及肉桂酰基
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高丝氨酸内酯(Cinn
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HSL)；
所述调控元件组包含：嵌合型别构转录因子，所述嵌合型别构转录因子包含调控结构域以及转录激活结构域；其中，所述调控结构域选自于由RpaR、BjaR以及BraR所组成的组；所述转录激活结构域选自于P65、VP16、VP64、VTR1、VTR2以及VTR3；以及在哺乳动物细胞中具有活性的诱导型启动子，所述诱导型启动子包含核心序列以及与所述嵌合型别构转录因子相互作用的至少一对操纵位点对。4.如权利要求3所述的调控元件组，其中，所述嵌合型别构转录因子的转录激活结构域为VTR3；优选地，所述嵌合型别构转录因子的调控结构域为RpaR，所述诱导型启动子的操纵位点为rpaO，所述诱导剂为pC
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HSL或Cinn
‑
HSL；优选地，所述诱导剂为pC
‑
HSL；优选地，所述嵌合型别构转录因子的调控结构域为BjaR，所述诱导型启动子的操纵位点为bjaO，所述诱导剂为IV
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HSL；优选地，所述嵌合型别构转录因子的调控结构域为BraR，所述诱导型启动子的操纵位点为braO、优选为R8；所述诱导剂为Cinn
‑
HSL；优选地，使用连接肽将所述嵌合型别构转录因子中的所述调控结构域与所述转录激活结构域相连；优选地，所述连接肽的长度为20
‑
60bp；优选地，所述连接肽具有SEQ ID NO：16的序列；优选地，所述嵌合型别构转录因子进一步包含核定位信号肽，其中，所述核定位信号肽位于所述嵌合型别构转录因子的N端或C端、或位于所述调控结构域与所述转录激活结构域之间，所述核定位信号肽包含1
‑
4个核定位序列；优选地，所述核定位序列的5
’
端和3
’
端各自独立地具有5
‑
40bp的侧翼序列；优选地，所述核定位信号肽位于所述调控结构域与所述转录激活结构域之间；优选地，所述核定位信号肽包含2个核定位序列，所述核定位序列的5
’
端和3
’
端各自独立地具有5
‑
20bp的侧翼序列；优选地，所述核定位序列具有SEQ ID NO：17的序列；优选地，所述嵌合型别构转录因子进一步包含多聚化结构域，优选地，所述多聚化结构域为CarH；优选地，使用连接肽将所述嵌合型别构转录因子中的所述调控结构域、所述多聚化结构域与所述转录激活结构域相连；优选地，所述连接肽各自独立地具有20
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60bp的长度；优选地，所述连接肽具有SEQ ID NO：16的序列；优选地，所述嵌合型别构转录因子进一步包含核定位信号肽，其中，所述核定位信号肽位于所述嵌合型别构转录因子的N端或C端、或者位于所述调控结构域与所述多聚化结构域之间、或者位于所述转录激活结构域与所述多聚化结构域之间，所述核定位信号肽包含1
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4个核定位序列；优选地，所述核定位序列的5
’
端和3
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端各自独立地具有5
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40bp的侧翼序列；优选地，所述核定位信号肽包含2个核定位序列，所述核定位序列的5
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端和3
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端各自独立地具有5
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20bp的侧翼序列；优选地，所述核定位序列具有SEQ ID NO：17的序列；优选地，所述核定位信号肽位于所述调控结构域与所述多聚化结构域之间、或者位于所述转录激活结构域与所述多聚化结构域之间；优选地，所述多聚化结构域的5
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端和3
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端进一步包含连接肽，优选地，所述连接肽各自独立地具有20
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60bp的长度；优选地，所述连接肽具有SEQ ID NO：16的序列；
优选地，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄春波，项延会，王卫军，李婷婷，陈茜，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：