腺嘌呤碱基编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种腺嘌呤碱基编辑系统及其应用。所述腺嘌呤碱基编辑系统包括：腺嘌呤碱基编辑器和sgRNA，所述腺嘌呤碱基编辑器的氨基酸序列如SEQ ID NO:6或7所示，所述sgRNA的靶向序列如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
腺嘌呤碱基编辑系统及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程和生物医药
，具体涉及一种腺嘌呤碱基编辑系统及编码其的核酸、包含其的重组表达载体组合、重组细胞、药物组合物及其应用。

技术介绍

[0002]血红蛋白E(Haemoglobin E，HbE)病是一种常见的遗传疾病，为一种珠蛋白编码基因(HBB)发生单氨基酸突变导致产生非正常结构的血红蛋白所致。HbE变异最常见于东南亚以及南亚。HbE是由编码β珠蛋白第26位正常谷氨酸的碱基“GAG”突变为编码赖氨酸的“AAG”所致，最终翻译成β
‑
珠蛋白链的第26位的谷氨酸被赖氨酸取代的异常血红蛋白HbE(Hbα2β2 26Glu
→
Lys，即E
→
K)。
[0003]而造成HbE的突变恰好激活一个隐秘的剪接位点，产生一定频率的RNA非正常剪接，该过程与正常剪接过程相竞争，导致正常剪接即编码HbE珠蛋白的信使RNA水平降低，因而最终HbE表达会有轻微降低的速率，最终表型仅属于β地中海贫血轻微型。
[0004]虽然单独的HbE突变不会造成明显的临床问题，但是，如果HbE突变与其他不同类型的α或β珠蛋白基因变异共同遗传而来，则会产生种类不同、严重程度各异的临床症状；如当HbE变异与另一类型的β珠蛋白基因变异共同遗传而来(即双重杂合子)，这种情况称为HbE/β地中海贫血(血红蛋白E/β地中海贫血)，属于显著的杂合基因型疾病，症状从轻微贫血到严重的重型β地中海贫血；血红蛋白E
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β地中海贫血是约占全世界所有严重β地中海贫血一半的基因型。
[0005]血红蛋白E(HbE)是东南亚的特点，也是最具地区局限性的一种病。HbE是东南亚最常见的异常血红蛋白，据估计约有三千万东南亚人为HbE杂合子，一百万人为HbE纯合子。
[0006]如果人的2个β珠蛋白基因之一由父母遗传得到血红蛋白E变异，这类人叫作HbE病原携带者，但其本人通常是健康的。如果人的2个β珠蛋白基因都从父母那里遗传得到HbE变异，这类人叫作HbE纯合，他们除了略有贫血外无其他大病。当人从父母一方遗传得到HbE基因，并从另一方遗传得到β型地中海贫血基因时，就很严重了。HbE/β
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地中海型贫血是严重的异常，临床症状可能和中度β地中海贫血类似，但是通常和重度地中海型贫血一样严重。
[0007]目前，输血依赖型的血红蛋白E/β地中海贫血需要长期输血和去铁治疗来维持生命，唯一根治的方式为异体造血干细胞移植术，但主要实施障碍是我国血液资源的紧缺、异体造血干细胞配型困难及移植相关并发症等。其中，利用慢病毒载体进行基因治疗，表现出极大的潜力，但是半随机的载体整合方式，具致癌风险。同时慢病毒中的表达元件在造血干细胞长期归巢和自我更新的过程中会逐渐沉默，使得疗效下降，即有可能无法达到终身治愈的目的。另外，临床所需的高浓度、高质量的慢病毒对设备和技术的要求极高，成本很难降低。因此，并行的、更加安全、成本更低的临床方案是非常有必要的。
[0008]碱基编辑技术是基于CRISPR/Cas系统发展起来的新型靶基因修饰技术，碱基编辑器技术可实现在不引入DNA双链断裂的情况下引入单碱基突变。碱基编辑器主要由两个部分组成——Cas蛋白和DNA修饰酶。迄今为止，由David R.Liu课题组分别在2016和2017年开
发出胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。这两类碱基编辑系统利用胞嘧啶脱氨酶或人工进化的腺嘌呤脱氨酶对靶位点进行精准的碱基编辑，最终可实现：对于胞嘧啶碱基编辑器，将C
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G碱基对替换为T
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A碱基对；对于腺嘌呤碱基编辑器，将A
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T碱基对替换为G
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C碱基对。在最初ABE开发过程中获得的较高效率的为第七代腺嘌呤碱基编辑器——ABE7.10，可将A
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T碱基对有效地转换为G
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C碱基对，在人293T细胞中某些位点的效率可高达50％。
[0009]为了进一步提高ABE与多种Cas同系物的兼容性和活性，David R.Liu组的研究人员于2020年3月份报道了运用一种新的噬菌体辅助进化系统而演化出来的新的第八代ABE突变体——ABE8e。相比于ABE7.10，ABE8e含有的脱氨酶TadA部分包含8个额外的突变，脱氨活性增加了590倍。研究者将ABE8e的脱氨酶TadA部分与包含SpCas9在内的各种Cas同系物配对，其编辑效率均得到了极大地提高。
[0010]虽然ABE8e编辑效率高，但编辑范围仍受到Cas蛋白部分的影响，如已有的核酸酶SpCas9受NGG PAM限制，这大大限制了腺嘌呤碱基编辑器在全基因组的应用范围。为解决该问题，在2020年3月，Benjamin P.Kleinstiver研究组通过基于结构的改造获得了几乎不受PAM限制的SpCas9突变体Cas9
‑
SPRY。因此，通过修复HbE遗传性单碱基突变对于治愈输血依赖型的HbE/β地中海贫血具有重大的临床应用价值。

技术实现思路

[0011]本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术缺少针对HBB基因高效、可无PAM限制进行单碱基突变修复的工具，提供一种腺嘌呤碱基编辑系统及其应用。本专利技术利用基因编辑技术修复血红蛋白E(HbE)单碱基突变，修复效率高且无PAM限制，能高效安全地修饰自体造血干/祖细胞持久平衡造血系统，具有极大的临床价值。
[0012]专利技术人先前研究提示，在患者造血干细胞中利用ABE蛋白能够高效地引入A
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T
→
G
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C突变，如果引入的这一突变突恰好靶向将β珠蛋白基因编码第26位HbE突变氨基酸的碱基“AAG”修复回编码正常谷氨酸的碱基“GAG”，再将高效编辑后的造血干细胞移植给患者重建造血，可具有治疗输血依赖型的血红蛋白E
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β地中海贫血的临床应用前景。因此，专利技术人尝试将现有的ABE8e的SpCas9部分改为突变体nCas9
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SPRY，并设计sgRNA进行验证，获得了既保持高编辑效率又消除PAM限制的新的腺嘌呤单碱基编辑器ABE8e
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SPRY，以及其与相应sgRNA的组合。
[0013]本专利技术通过以下技术方案解决上述技术问题。
[0014]本专利技术的第一方面提供一种腺嘌呤碱基编辑系统，所述腺嘌呤碱基编辑系统包括：腺嘌呤碱基编辑器和sgRNA；所述腺嘌呤碱基编辑器的氨基酸序列如SEQ ID NO:6或7所示，所述sgRNA的靶向序列如SEQ ID NO:1
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5任一项所示。
[0015]所述氨基酸序列包括与SEQ ID NO:6或7所示序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％以上同源性的序列且具有与SEQ ID NO:6或7所示腺嘌呤碱基编辑器相同或相似的功能。
[0016]本专利技术中，所述腺嘌呤碱基编本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种腺嘌呤碱基编辑系统，其特征在于，其包括：腺嘌呤碱基编辑器和sgRNA，所述腺嘌呤碱基编辑器的氨基酸序列如SEQ ID NO:6或7所示，所述sgRNA的靶向序列如SEQ ID NO:1
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5任一项所示。2.如权利要求1所述的腺嘌呤碱基编辑系统，其特征在于，编码所述腺嘌呤碱基编辑器的核苷酸序列如SEQ ID NO:12或13所示；和/或，当所述腺嘌呤碱基编辑蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示时，所述sgRNA的靶向序列如SEQ ID NO:1所示；当所述腺嘌呤碱基编辑蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示时，所述sgRNA的靶向序列如SEQ ID NO:1
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5任一项所示；较佳地，所述sgRNA的靶向序列如SEQ ID NO:2所示。3.一种sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶向序列选自如SEQ ID NO:1
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5任一项所示的一种或多种。4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1或2所述的腺嘌呤碱基编辑系统，或者如权利要求3所述的sgRNA；较佳地，所述药物组合物还包括药物递送系统；更佳地，所述药物递送系统为脂质体、外泌体、噬菌体或微细胞。5.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1或2所述的腺嘌呤碱基编辑系统、或者如权利要求3所述的sgRNA。6.一种重组表达载体组合，其特征在于，所述重组表达载体组合包含如权利要求5所述的核酸。7.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含如权利要求1或2所述的腺嘌呤碱基编辑系统、如权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴宇轩，陈双红，廖娇阳，萧圣霖，蒋艳红，席在喜，刘明耀，
申请(专利权)人：上海邦耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：