一种基于LAMP扩增的荧光检测与CRISPR/Cas检测的双重检测体系及应用制造技术

本发明专利技术涉及基于LAMP扩增的荧光检测与CRISPR/Cas检测的双重检测体系及应用；属于核酸检测技术领域。一种基于LAMP扩增的CRISPR/Cas和荧光检测的双重检测体系，包括靶序列扩增引物、能够识别靶序列的荧光报告探针、指示等温扩增反应是否有目标产物产生的荧光显示剂、反应缓冲液、增强缓冲液、包含DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶的酶混合液、能够引导所述的CRISPR/Cas蛋白酶识别靶序列的sgRNA。本发明专利技术具有操作简便、使用成本低、灵敏度高、特异性高的特点，可以同时实现：a）、检测内标，和b）检测靶标或区分样本病原体的属和种。靶标或区分样本病原体的属和种。靶标或区分样本病原体的属和种。

【技术实现步骤摘要】
一种基于LAMP扩增的荧光检测与CRISPR/Cas检测的双重检测体系及应用


[0001]本专利技术涉及基于LAMP扩增的荧光检测与CRISPR/Cas检测的双重检测体系及应用；属于核酸检测


技术介绍

[0002]等温扩增技术(isothermal amplification technology，ITA)是近年来发展起来的基于恒温扩增的新型核酸扩增技术，被许多学者认为是一种有可能与PCR媲美的检测方法。PCR技术原理是利用94℃高温使DNA双链解开，并在耐高温的DNA聚合酶的作用下扩增DNA片段。至少需要2个不同的温度，经过1小时以上特异性的扩增得到目的DNA。而恒温核酸扩增是利用各种酶与DNA之间的反应使核酸在同一温度下得到扩增。目前常见的等温核酸扩增技术包括LAMP、NERA、NASBA、RCA、HDA、RPA和ERA。在这些扩增技术中LAMP扩增DNA的效率高，能够在1h内有效的扩增1
‑
10拷贝的目的基因，扩增效率是普通PCR的10倍
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100倍，反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备。若在体系中加入逆转录酶，能够实现RNA的扩增，对样本的包容性强。
[0003]LAMP的扩增产物检测手段主要包括：
[0004]1)、浊度法：通过肉眼观察或者浊度仪检测焦磷酸沉淀，此检测方法无特异性；
[0005]2)、普通电泳法：将LAMP扩增产物进行普通凝胶电泳，此检测方法也无特异性，且操作复杂耗时，容易形成气溶胶，造成假阳性影响检测结果；
[0006]3)、荧光染料染色法：反应中加入荧光染料通过荧光检测仪收集荧光进行结果的判定。染料主要包括：SYBR Green I、羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol blue，HNB)、钙黄绿素。但是SYBR Green I染料只要扩增出核酸便显示阳性，特异性弱；羟基萘酚蓝与钙黄绿素均是指示LAMP的副产物镁离子的变化，也无特异性，且多为单个靶点的检测；
[0007]4)、TaqMan荧光探针检测法：基于PCR扩增时Taq酶的5
′→3′
外切酶活性将探针酶切降解。但LAMP扩增用的DNA聚合酶大多自然缺失5
′→3′
外切酶活性，很难或者无法进行探针的酶切和降解；
[0008]5)、双重信标检测法：分子信标在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。等温扩增的温度可能达不到变性温度，而且分子信标探针杂交时，探针不能完全肯定与模板结合，稳定性差；
[0009]6)、校对酶介导的探针裂解检测技术：在TaqMan荧光探针基础上，引入一个校对酶，补足BST酶缺失5
′→3′
外切酶活性。校对聚合酶是一种以比标准Taq更高的保真度复制DNA的酶。但是在某些时候校对聚合酶的校对功能会将不正确的核苷酸添加到正在生长的DNA链上，导致模板与新合成的链之间不匹配，会对LAMP扩增产生影响。
[0010]以上检测手段在一定程度上优化了LAMP检测方法，但这些方法依旧存在缺点和局限性。而随着CRISPR/Cas检测技术的发展，尝试通过CRISPR/Cas检测技术，提高LAMP检测的
特异性性，打破检测的局限性成为一个新的突破点。
[0011]CRISPR/Cas系统的检测技术主要是利用CRISPR/Cas系统原有的适应、表达和干扰3个阶段，进行针对性的改造以实现特异性靶标的检测。通过人工设计向导RNA(Single
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guide RNA，sgRNA)，使其特异性识别靶序列后，Cas蛋白裂解靶序列从而形成特异性的双链断裂(Double strand breaks，DSB)，而sgRNA的结构取决于所用的Cas蛋白。基于Cas12、Cas13及Cas14的核酸检测方法依赖于Cas蛋白的附属切割活性，其中Cas13靶向ssRNA，Cas12和14靶向ssDNA。当Cas蛋白与sgRNA、靶序列形成效应复合物时，其附属切割活性被激活，对已被标记的ssRNA或ssDNA报告基因进行切割，从而释放出信号达到检测效果。
[0012]利用CRISPR/Cas系统特异的序列识别及切割活性，将其应用于与LAMP扩增相结合，为提高检测灵敏度、特异性等性能指标以及实现双重检测提供了一种新思路。据目前所了解，LAMP扩增敏感性强，特别容易形成气溶胶，造成假阳性影响检测结果。其检测方式多，但存在特异性差以及不稳定的问题。此外，目前的LAMP扩增检测多数为单靶点检测，缺少对扩增体系监测、区分种属的多重检测方法。而待检样本通常是从比较复杂的物质中提取出来的核酸，易对反应体系产生影响，如抑制等温扩增反应。当检测结果为阴性时，我们无法判断是待测样本中无靶标核酸检不出，还是由于扩增受抑制导致检不出。故目前在分子诊断的应用中，往往都需要对扩增反应本身进行质控，比如对人源内标或自行投入内质控品等同时进行扩增检测，以判断反应本身的有效性，而现有的单靶标检测方法都不能很好的满足这个需求。

技术实现思路

[0013]要解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供了一种基于LAMP扩增的荧光检测和CRISPR/Cas检测的双重检测体系。本专利技术的双重检测体系可以同时对同一样本以两个靶标的方式进行检测，其中一个靶标对样本进行是否扩增出靶序列核酸的荧光检测；另一靶标利用CRISPR/Cas对样本进行是否包含靶序列的包含内参检验的特异性检测。最后由荧光定量仪实时读取荧光数值，根据荧光起始值及信号强弱对检验结果进行分析判定。从而在单管中同时实现：a)、检测内标和靶标、b)区分样本病原体的属和种。
[0014]本专利技术解决上述问题的技术方案如下：
[0015]一种基于LAMP扩增的CRISPR/Cas和荧光检测的双重检测体系，包括靶序列扩增引物、能够识别靶序列的荧光报告探针、指示等温扩增反应是否有目标产物产生的荧光显示剂、反应缓冲液、增强缓冲液、包含DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶的酶混合液、能够引导所述的CRISPR/Cas蛋白酶识别靶序列的sgRNA。
[0016]本专利技术提出的检测体系，操作简单，能够在单个反应管内同时进行双靶标的扩增和检测，减少开管反应的污染风险，对温控要求低，可降低实验室设备要求，缩短检测时间，自动化程度高。
[0017]本专利技术提出的检测体系是对待测样本中脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸(还需加逆转录酶)进行扩增检测，具有灵敏度高，特异性强，适用于简便快速的核酸检测。
[0018]所述的DNA聚合酶，是一种具有链置换作用的DNA聚合酶，可置换下游的DNA链而不需要模板变性。可以是BST 2.0DNA聚合酶，BST 3.0DNA聚合酶、Warmstar BST 2.0DNA聚合酶、BST LF DNA聚合酶、OmniAmp DNA聚合酶。
[0019]所述的CRISPR/Cas蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于LAMP扩增的荧光检测和CRISPR/Cas检测的双重检测体系，其特征在于：包括靶序列扩增引物、内参扩增引物、指示等温扩增反应是否有目标产物产生的荧光显示剂、反应缓冲液、增强缓冲液、包含DNA聚合酶和CRISPR/Cas蛋白酶的酶混合液、能够引导所述的CRISPR/Cas蛋白酶识别靶序列的sgRNA。2.根据权利要求1所述的一种基于LAMP扩增的荧光检测和CRISPR/Cas检测的双重检测体系，其特征在于：所述的荧光染料包括但不限于SYBRGreen、EvaGreen。3.根据权利要求1所述的一种基于LAMP扩增的荧光检测和CRISPR/Cas检测的双重检测体系，其特征在于：所述的荧光染料为EvaGreen，其终浓度用量在0.1x~1x。4.根据权利要求1所述的一种基于LAMP扩增的荧光检测和CRISPR/Cas检测的双重检测体系，其特征在于：所述的反应增强剂包括但不限于牛磺酸、甜菜碱、海藻糖或BSA。5.根据权利要求1所述的一种基于LAMP扩增的荧光检测和CRISPR/Cas检测的双重检测体系，其特征在于：所述的反应缓冲液包括Tris
‑
HCl，dNTPs，Tween
‑
20或Trit...

【专利技术属性】
技术研发人员：方昭青，张鑫鑫，肖丽娜，高晓庆，徐丹，韩序，王珺，
申请(专利权)人：杭州杰毅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：