酿酒酵母从头合成柚皮素工程菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种酿酒酵母从头合成柚皮素工程菌株及其构建方法与应用，上述工程菌按如下方法对酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2

【技术实现步骤摘要】
酿酒酵母从头合成柚皮素工程菌株及其构建方法与应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种采用增强酪氨酸代谢通量和基因组delta多拷贝位点整合促进异源基因高效表达的组合策略，尤其涉及一种生产柚皮素的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。
(二)
技术介绍

[0002]柚皮素是黄酮类化合物的核心骨架结构，作为平台化合物可衍生大量黄酮类物质，具有抗病毒、抗菌、抗高血压和抗氧化等多种生理活性，广泛应用于食品、化工、医药等行业。鉴于植物提取和化学合成的局限性，柚皮素的生物合成已成为研究热点。以植物代谢途径为参照，目前已报道的异源合成柚皮素有2条代谢通路：以酪氨酸为底物，在酪氨酸解氨酶(TAL)催化下生成对香豆酸，随后在4
‑
香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)催化下合成对香豆酰
‑
CoA，再经由查尔酮合酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)催化下分别合成柚皮素查尔酮和柚皮素；由酪氨酸合成柚皮素的途径是目前研究的热门方案。在另一条途径中，由苯丙氨酸通过5步酶催化反应合成柚皮素，分别为：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸
‑4‑
羟化酶(C4H)、4CL、CHS和CHI。苯丙氨酸合成方案涉及了C4H，该酶属于P450酶，需要由P450还原酶将其转化为氧化还原形态，并且需要锚定在内质网上完成催化反应，限制了该通路在原核表达系统中的应用。
[0003]通过微生物发酵法来合成柚皮素是降低黄酮类化合物成本的理想来源，同时也满足绿色、资源环保理念。酿酒酵母作为GRAS(generally regarded as safe)生物，具有良好的遗传背景、优异的抗逆性、优异的发酵特性、稳定的生产性能和较高的安全性，已成为生产柚皮素的一种有吸引力的微生物宿主。
(三)
技术实现思路

[0004]本专利技术的第一个目的是提供一种生产酪氨酸的酿酒酵母工程菌，所述的工程菌以S.cerevisiae CEN.PK2
‑
1C为底盘菌，通过代谢改造，得到高产L
‑
酪氨酸的酿酒酵母T01菌株。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供一种实现并强化柚皮素从头合成的酿酒酵母工程菌。所述工程菌是以高产酪氨酸T01菌株为宿主，以高拷贝2μ质粒过表达RgTAL和Sc4CL，实现柚皮素从头合成菌株(N01)的构建；随后，通过将Sc4CL和HaCHS表达盒整合至delta位点(该菌株命名为N02)，显著促进了柚皮素的合成并对生物量无明显影响。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种重组表达质粒，所述重组表达质粒含有酪氨酸解氨酶基因(TAL)和4
‑
香豆酸:辅酶A连接酶基因(4CL)。
[0008]在本专利技术的一个实施例中，所述重组表达质粒的载体为pESC
‑
His，所述酪氨酸解氨酶基因连接有TEF启动子控制表达。另外，为进行质粒筛选，所述TEF启动子还可携带筛选基因，如潮霉素抗性基因。
[0009]在本专利技术的一个实施例中，所述酪氨酸解氨酶基因编码如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列，来源于Rhodotorula glutinis；所述4
‑
香豆酸:辅酶A连接酶基因编码如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列，来源于Streptomyces coelicolor。上述基因在插入宿主菌时需要相应做密码子优化为本领域的公知常识。
[0010]在本专利技术的一个实施例中，所述重组表达质粒被命名为pESC
‑
TAL
‑
4CL
‑
HygR质粒。
[0011]第二方面，本专利技术提供一种含上述重组表达质粒的基因工程菌，所述基因工程菌的宿主菌是S.cerevisiae CEN.PK2
‑
1C菌株经如下改造获得的：将gal80基因替换为查尔酮合酶基因的表达盒A，将aro10基因替换为查尔酮异构酶基因的表达盒，敲除pdc5基因和gal2基因，将PHA2基因替换为aro7
G141S
基因的表达盒，TRP2替换为aro4
k229L
基因的表达盒，得到所述宿主菌。
[0012]所述aro7
G141S
基因的表达盒编码的氨基酸序列是将aro7基因编码的氨基酸序列的141位甘氨酸突变为丝氨酸，所述aro7
G141S
基因的表达盒编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述aro7
G141S
基因的表达盒的启动子和终止子分别是PGK1启动子和HXT7终止子。所述aro4
k229L
基因的表达盒编码的氨基酸序列是将aro4基因的表达盒编码的氨基酸序列的229位赖氨酸突变为亮氨酸，所述aro4
k229L
基因的表达盒编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述aro4
k229L
基因的表达盒的启动子和终止子分别是TEF1启动子和CYC1终止子。
[0013]在本专利技术的一个实施例中，所述查尔酮合酶(CHS)基因的表达盒A的启动子和终止子分别是gal7启动子和CYC1终止子，所述查尔酮合酶(CHS)基因的表达盒A编辑的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述查尔酮异构酶(CHI)基因的表达盒的启动子和终止子分别是gal1启动子和ADH1终止子，所述查尔酮异构酶(CHI)基因的表达盒编辑的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0014]优选地，所述基因工程菌进一步进行如下改造：将查尔酮合酶基因的表达盒B和4
‑
香豆酸:辅酶A连接酶基因的表达盒一同整合至所述基因工程菌的delta位点，得到高产柚皮素的基因工程菌。
[0015]进一步，上述改造都采用CRISPR
‑
Cas9单质粒基因编辑系统完成。在本专利技术的一个实施例中，改造前先将Cas9表达盒(P
TEF
‑
spCas9
‑
T
ADH2
)整合至S.cerevisiae CEN.PK2
‑
1C菌株的基因组的IX
‑
1位点，以优化CRISPR
‑
Cas9双质粒基因编辑系统。采取Di
‑
CRISPR/Cas9(delta
‑
integration)技术，设计gRNA靶向酵母基因组上delta序列，在双链断裂处(DSB,double stranded breaks)实现柚皮素合成途径中Sc4CL和HaCHS Donor DNA的简单高效性整合。但本领域人员应当知晓，采用其它基因编辑方法进行的相同或类似改造也在本专利技术的保护范围内。
[0016]在本专利技术的一个实施例中，所述查尔酮合酶基因的表达盒B的启动子和终止子分别是ERG20启动子和CYC1终止子；4
‑
香豆酸:辅酶A连接酶基因的表达盒的启动子和终止子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒含有酪氨酸解氨酶基因和4
‑
香豆酸:辅酶A连接酶基因。2.如权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒的载体为pESC
‑
His，所述酪氨酸解氨酶基因连接有TEF启动子控制表达。3.如权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于：所述酪氨酸解氨酶基因编码如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列；所述4
‑
香豆酸:辅酶A连接酶基因编码如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列。4.含如权利要求1所述的重组表达质粒的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的宿主菌是S.cerevisiae CEN.PK2
‑
1C菌株经如下改造获得的：将gal80基因替换为查尔酮合酶基因的表达盒A，将aro10基因替换为查尔酮异构酶基因的表达盒，敲除pdc5基因和gal2基因，将PHA2基因替换为aro7
G141S
基因的表达盒，TRP2替换为aro4
k229L
基因的表达盒，得到所述宿主菌。5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于：所述aro7
G141S
基因的表达盒编码的氨基酸序列是将aro7基因编码的氨基酸序列的141位甘氨酸突变为丝氨酸，所述aro7
G141S
基因的表达盒编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；所述aro7
G141S
基因的表达盒的启动子和终止子分别是PGK1启动子和HXT7终止子；所述aro4
k229L
基因的表达盒编码的氨基酸序列是将aro4基...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，金黎媛，赵嫚，成浩，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：