一种用于血浆游离DNA的提取试剂盒及其方法技术

本发明专利技术提供了一种用于血浆游离DNA的提取试剂盒，包括多种提取溶液，至少一种提取溶液中含有0.01～0.5mmol/L的糖原、体积/体积比为0.5％～1.5％的鲸蜡基聚二甲基硅氧烷。常规对血浆游离DNA进行提取时，需采用酚/氯仿抽提的试剂盒，大多通过酚、氯仿和异戊醇来变性蛋白质使其沉降，并使液体分层，再用乙醇等沉淀离心，达到提取目的，但该操作繁琐。本发明专利技术通过采用糖原、鲸蜡基聚二甲基硅氧烷，直接通过提取溶液实现裂解和结合的同时进行，不需要单独加入结合液，具有操作步骤简单，提取时间缩短，核酸提取效率提高的优点。酸提取效率提高的优点。酸提取效率提高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于血浆游离DNA的提取试剂盒及其方法


[0001]本专利技术属于分子诊断DNA/RNA提取领域，具体涉及一种磁珠法提取大体积血浆游离DNA试剂盒以及提取血浆游离DNA的方法。

技术介绍

[0002]游离DNA简称cfDNA(circulating free DNA)，是指循环血液中的核酸类物质。包括循环血液中细胞内的核酸，游离的内源性脱氧核糖核酸和外源性DNA与RNA，如真菌血症、细菌血症和病毒血症等病理情形下的血中外源核酸。cfDNA在疾病的早期诊断、预后、监测等方面具有重要潜在价值，在产前诊断、免疫性疾病等非肿瘤类疾病的病情分析与疗效观察、肿瘤相关分析中具有巨大的应用价值。由于缺乏高灵敏性和高特异性的实验方法，导致有关cfDNA与疾病相关性的研究在较长时期内进展缓慢。直到有效分离cfDNA技术的出现，和特殊荧光染料与PCR技术相结合的检测技术的应用，使这一领域的研究在最近二十多年得到了较迅速发展。
[0003]随着精准医学概念的提出，精准医学已经逐渐被人们接受，肿瘤便是精准医学首要解决任务之一。液体活检(Liquid biopsy)作为体外诊断的一个分支，是以一种非侵入式的血液测试来监测肿瘤或转移病灶释放到血液中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)和循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)碎片的方法。最近比较火热的液体活检包括cfDNA、ctDNA和CTCs的检测，cfDNA的检测已经成为为癌症诊断与监测的灵敏的生物标志物，针对cfDNA的提取也越来越受到重视。
[0004]目前市场上游离DNA提取富集试剂盒中的溶液是根据不同的提取方法相应设计，比如基于酚/氯仿抽提的试剂盒，大多通过酚、氯仿和异戊醇来变性蛋白质使其沉降，并使液体分层，再用乙醇等沉淀离心，达到提取目的；但上述有机溶剂有一定的毒性，不利于技术人员操作，而且在提取过程中cfDNA的丢失率达到70％～80％。而离心柱法和磁珠法则多采用高盐低pH的原理制备结合液，使得核酸在该条件下与离心柱的硅胶膜或磁珠相结合；再采用低盐高pH的条件制备洗脱液，便于核酸洗脱。离心柱法虽然操作方便快捷，能有效去除样本中的各种杂质，但成本较高，需要多步高速离心，需要更换离心管，没有高通量仪器配套，不适合临床大规模样本检测。磁珠法是纳米科技与生物技术的完美结合，具有其他DNA提取方法无法比拟的优势，主要体现在：能够实现自动化、高通量操作；操作简单、用时短；磁珠法对血浆游离DNA的提取效率最高，丢失率最小，重复性较好。本试剂盒对磁珠分离cfDNA的方法进行了进一步的改进，简化了实验操作步骤，操作简单快捷，获得的DNA纯度高，适合于小片段DNA的提取。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种用于血浆游离DNA的提取试剂盒及其方法，以简化提取过程，提高提取效率。
[0006]本专利技术提供了一种用于血浆游离DNA的提取试剂盒，包括多种提取溶液，至少一种
提取溶液中含有糖原和鲸蜡基聚二甲基硅氧烷。
[0007]进一步地，所述至少一种提取溶液中含有0.01～0.5mmol/L的糖原和体积/体积比为0.5％～1.5％的鲸蜡基聚二甲基硅氧烷；优选地，鲸蜡基聚二甲基硅氧烷的体积/体积比为0.8％～1.2％；更优选地，鲸蜡基聚二甲基硅氧烷的体积/体积比为1％。例如，在本专利技术中，鲸蜡基聚二甲基硅氧烷体积/体积比为0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％的提取溶液均能够对血浆游离DNA进行高效提取。
[0008]进一步地，所述多种提取溶液中包括第一提取溶液，所述第一提取溶液包括3～4mol/L的硫氰酸胍、0.01～0.5mmol/L的糖原、体积/体积比为1％～3％的乙基苯基聚乙二醇、体积/体积比为0.25％～1.0％的吐温20、体积/体积比为0.5％～1.5％的鲸蜡基聚二甲基硅氧烷、质量/体积比为0.5％～1.5％的曲拉通X
‑
100、体积/体积比为30％～45％的异丙醇、5～15mmol/L的Tris
‑
HCl。
[0009]更进一步地，所述多种提取溶液中还包括第二提取溶液，所述第二提取溶液包括0.2～1.0mg/ml磁珠、5～15mmol/L的Tris
‑
HCl、0.5～1.5mmol/L的EDTA。
[0010]更进一步地，所述多种提取溶液中还包括第三提取溶液，所述第三提取溶液包括10～30mg/ml的蛋白酶K。
[0011]更进一步地，所述提取试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液至少包括第一洗涤液，所述第一洗涤液包括：1～2mol/L的硫氰酸胍、100～200mmol/ml的NaAc
‑
HAc、10～50mmol/L的Tris
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HCl、体积/体积比为0.5％～5％的乙基苯基聚乙二醇、体积/体积比为1％～5％的吐温20、质量/体积比为1％～5％的曲拉通X
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100、体积/体积比为10％～30％的异丙醇。
[0012]更进一步地，所述洗涤液还包括第二洗涤液，所述第二洗涤液包括：乙醇，5～15mmol/L Tris
‑
HCl。
[0013]更进一步地，所述提取试剂盒还包括洗脱液，所述洗脱液包括5～15mmol/L的Tris
‑
HCl、0.5～1.5mmol/L的EDTA、0.02％～0.1％的吐温20。
[0014]本专利技术第二方面公开一种上述任意一项提取试剂盒使用方法，包括提取过程，所述提取过程为：将1体积样品与总量为1.5～3体积的多种提取溶液混合，并进行提取；
[0015]其中，含有糖原、鲸蜡基聚二甲基硅氧烷的所述提取溶液占所述多种提取溶液体积总量的80％～95％。
[0016]本专利技术第三方面公开一种上述任意一项提取试剂盒使用方法，包括步骤如下：
[0017]S1.将1体积样品、1.2～2.5体积第一提取溶液、0.05～0.25体积第二提取溶液、0.05～0.25体积第三提取溶液混合；震荡并加热；
[0018]S2.室温静置后离心，进行磁性分离，并去除废液；
[0019]S3.加入洗涤液进行洗涤；
[0020]S4.室温静置；
[0021]S5.加入0.05～1体积洗脱液，震荡混匀后，将磁珠洗脱，并离心后，磁吸，获取洗脱下来的核酸，得到提取后的核酸。
[0022]进一步地，所述洗涤液包括第一洗涤液、第二洗涤液，所述S3.加入洗涤液进行洗涤包括：
[0023]S31.加入0.5～2体积第一洗涤液，震荡混匀，并离心后，磁吸，去除液体；
[0024]S32.加入0.5～2体积第二洗涤液，震荡混匀，并离心后，磁吸，去除液体；
[0025]S33.加入0.2～1体积第二洗涤液，震荡混匀，并离心后，磁吸，去除液体。
[0026]与常规游离DNA提取方法相比，本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于血浆游离DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述提取试剂盒包括多种提取溶液，至少一种提取溶液中含有糖原和鲸蜡基聚二甲基硅氧烷。2.根据权利要求1所述的一种用于血浆游离DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述至少一种提取溶液中含有0.01～0.5mmol/L的糖原和体积/体积比为0.5％～1.5％的鲸蜡基聚二甲基硅氧烷。3.根据权利要求2所述的一种用于血浆游离DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述多种提取溶液中包括第一提取溶液，所述第一提取溶液包括3～4mol/L的硫氰酸胍、0.01～0.5mmol/L的糖原、体积/体积比为1％～3％的乙基苯基聚乙二醇、体积/体积比为0.25％～1.0％的吐温20、体积/体积比为0.5％～1.5％的鲸蜡基聚二甲基硅氧烷、质量/体积比为0.5％～1.5％的曲拉通X
‑
100、体积/体积比为30％～45％的异丙醇、5～15mmol/L的Tris
‑
HCl。4.根据权利要求1
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3任一项所述的一种用于血浆游离DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述多种提取溶液中还包括第二提取溶液，所述第二提取溶液包括0.2～1.0mg/ml磁珠、5～15mmol/L的Tris
‑
HCl、0.5～1.5mmol/L的EDTA；和/或，第三提取溶液，所述第三提取溶液包括10～30mg/ml的蛋白酶K。5.根据权利要求4所述的一种用于血浆游离DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述提取试剂盒还包括洗涤液。6.根据权利要求5所述的一种用于血浆游离DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括第一洗涤液，所述第一洗涤液包括1～2mol/L的硫氰酸胍、100～200mmol/ml的NaAc
‑
HAc、10～50mmol/L的Tris
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HCl、体积/体积比为0.5％～5％的乙基苯基聚乙二醇、体积/体积比...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴康，田雨苏，龙凤英，贺婷，刘佳，戴立忠，
申请(专利权)人：圣湘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：