一种抑制鸭圆环病毒基因表达的shRNA制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，涉及一种抑制鸭圆环病毒基因表达的shRNA，上述shRNA为人工合成，可以抑制鸭圆环病毒的Rep和Cap基因表达，从而起到抑制病毒在鸭体内复制的作用。通过实验证实，注射含有shRNA干扰序列的重组质粒能够显著抑制病毒在鸭体内的复制，与对照组相比，病毒拷贝数最大降低了100倍，在鸭圆环病毒临床防控方面具有重要意义。临床防控方面具有重要意义。临床防控方面具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制鸭圆环病毒基因表达的shRNA


[0001]本专利技术属于基因工程及其应用领域，涉及一种抑制鸭圆环病毒基因表达的shRNA。

技术介绍

[0002]鸭圆环病毒(duck circovirus，DuCV)是圆环病毒科圆环病毒属的成员，无囊膜，遗传物质为单股环型DNA结构。该病毒由Hanemann于2003年在德国首次报道。在我国，姜世金等(2007)首次从2006年在福建省采集的鸭疫里默氏菌病鸭样品中检测到DuCV。刘少宁等(2008
‑
2009)对来自山东、江苏、四川、福建和广东5个省份36个鸭群343份组织样品进行检测，发现DuCV检出率高达81.63％，鸭群阳性率达94.44％；其中山东18个肉鸭场阳性率为88.89％，12个种鸭场的阳性率为75％。这些数据说明十几年前鸭圆环病毒已经在中国主要养鸭省市鸭群中普遍感染。从2018
‑
2021年对全国各地发病鸭群的检测数据来看，DuCV的感染率仍然极高，是鸭群中感染率最高的病毒，并且多数与大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、腺病毒、鸭细小病毒、坦布苏病毒、呼肠孤病毒、流感病毒等病原混感。对混感鸭群治疗发现，只要混感有DuCV的鸭群，都难以达到良好的治疗效果。DuCV感染过程缓慢，通常本身不造成明显的临床症状，因此非常容易被忽视，由于它主要侵害鸭的免疫系统，导致鸭抵抗力下降，因此极易造成其它病原的继发感染，严重影响治疗效果，能够造成巨大的经济损失。
[0003]由于目前DuCV在动物细胞和禽胚上难以增殖培养，因此目前尚无商品化疫苗。卵黄抗体是抗病毒常用的生物制剂，是从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有特异性的IgY类抗体，故称其为卵黄免疫球蛋白IgY。目前，实验室研究表明抗鸭圆环病毒卵黄抗体对临床治疗鸭圆环病毒感染有效。专利技术人团队也使用鸭圆环病毒感染雏鸭的肝脏组织制作组织灭活苗，并免疫蛋鸡制备了抗鸭圆环病毒卵黄抗体并进行了临床效果检验，结果表明单独的抗鸭圆环病毒卵黄抗体确实能够显著降低感染率和发病率，但是抑制效果有限，仍需要进一步提高治疗效果。因此，研制新型抗鸭圆环病毒感染药物是一个亟待解决的课题。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的上述情况，本专利技术的专利技术人提供了一种抑制鸭圆环病毒基因表达的shRNA，上述shRNA为人工合成，可以抑制鸭圆环病毒的Rep和Cap基因表达，从而起到抑制病毒在鸭体内复制的作用。通过实验证实，注射含有shRNA干扰序列的重组质粒能够显著抑制病毒在鸭体内的复制，与对照组相比，病毒拷贝数最大降低了100倍，在鸭圆环病毒临床防控方面具有重要意义。
[0005]本专利技术的具体原理如下：
[0006]RNA干扰(RNAi)存在于各种真核生物细胞中，是一种进化保守的基因沉默机制，能够以序列特异性方式降解相应的mRNA，从而导致靶基因的沉默。RNAi的抗病毒作用最先是在植物体内被发现的，是植物体内重要的抗病毒方式。这一机制发现为动物体内的抗病毒治疗提供了一种新策略。目前，已经在动物体内实现了由小干扰RNA和短发卡RNA(siRNA和
shRNA)介导的病毒mRNA降解，从而抑制病毒在体内的增殖。短发卡RNA是一种能够克隆到表达载体并表达siRNA的双链DNA分子。与使用合成的siRNA相比，shRNA在沉默靶基因方面具有多种优势，例如稳定性高、递送方式简单、成本低等特点，能够通过注射直接抑制动物体内的病毒复制，在治疗动物病毒性疾病方面具有广阔前景。因此，专利技术人设计了一种抑制DuCV基因表达的shRNA干扰序列，直接注射含有干扰序列的重组质粒能够显著抑制病毒在鸭体内的复制，若进一步与抗鸭圆环病毒卵黄抗体合同使用能够取得更加优良的抗鸭圆环病毒感染的效果，值得临床推广应用。
[0007]本专利技术的具体技术方案如下：
[0008]一种抑制鸭圆环病毒基因表达的shRNA，具体为Rep
‑
1、Rep
‑
2、Cap
‑
1、Ca p
‑
2中的任意一条，每条shRNA干扰序列包括正链和负链，其中：
[0009]Rep
‑
1正链：5
’‑
GATCCGCAAGAGGTGGGTCTTTACCATTAAT CTGTGAAGCCACAGATG GGATTAATGGTAAAGACCCACCTCTTGCTTTTTTA
‑3’
，如SEQ ID NO.1所示；
[0010]Rep
‑
1负链：5
’‑
AGCTTAAAAAAGCAAGAGGTGGGTCTTTACCATTAAT CCCATCTGTGG CTTCACAGATTAATGGTAAAGACCCACCTCTTGCG
‑3’
，如SEQ ID NO.2所示；
[0011]Rep
‑
2正链：5
’‑
GATCCGCCTAATCGTCGAGACGCAACGTGAT CTGTGAAGCCACAGATG GGATCACGTTGCGTCTCGACGATTAGGCTTTTTTA
‑3’
，如SEQ ID NO.3所示；
[0012]Rep
‑
2负链：5
’‑
AGCTTAAAAAAGCCTAATCGTCGAGACGCAACGTGAT CCCATCTGTGG CTTCACAGATCACGTTGCGTCTCGACGATTAGGCG
‑3’
，如SEQ ID NO.4所示；
[0013]Cap
‑
1正链：5
’‑
GATCCGCGATTCGTAGCCTTCGTCTTCTGAA CTGTGAAGCCACAGATG GGTTCAGAAGACGAAGGCTACGAATCGCTTTTTTA
‑3’
，如SEQ ID NO.5所示；
[0014]Cap
‑
1负链：5
’‑
AGCTTAAAAAAGCGATTCGTAGCCTTCGTCTTCTGAA CCCATCTGTGG CTTCACAGTTCAGAAGACGAAGGCTACGAATCGCG
‑3’
，如SEQ ID NO.6所示；
[0015]Cap
‑
2正链：5
’‑
GATCCGCCACTCCTGTTGTGTTGTCTGGTTT CTGTGAAGCCACAGATG GG AAACCAGACAACACAACAGGAGTGGCTTTTTTA
‑3’
，如SEQ ID NO.7所示；
[0016]Cap
‑
2负链：5
’‑
AGCTTAAAAAAGCCACTCCTGTTGTGTTGTCTGGTTT CCCATCTGTGG CTTCACAGAAACCAGACAACACAACAGGAGTGGCG
‑3’
，如S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抑制鸭圆环病毒基因表达的shRNA，其特征在于：具体为Rep
‑
1、Rep
‑
2、Cap
‑
1、Cap
‑
2中的任意一条，每条shRNA干扰序列包括正链和负链。2.根据权利要求1所述的抑制鸭圆环病毒基因表达的shRNA，其特征在于：Rep
‑
1正链：5
’‑
GATCCGCAAGAGGTGGGTCTTTACCATTAAT CTGTGAAGCCACAGATG GGATTAATGGTAAAGACCCACCTCTTGCTTTTTTA
‑3’
，如SEQ ID NO.1所示；Rep
‑
1负链：5
’‑
AGCTTAAAAAAGCAAGAGGTGGGTCTTTACCATTAAT CCCATCTGTGG CTTCACAGATTAATGGTAAAGACCCACCTCTTGCG
‑3’
，如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的抑制鸭圆环病毒基因表达的shRNA，其特征在于：Rep
‑
2正链：5
’‑
GATCCGCCTAATCGTCGAGACGCAACGTGAT CTGTGAAGCCACAGATG GGATCACGTTGCGTCTCGACGATTAGGCTTTTTTA
‑3’
，如SEQ ID NO.3所示；Rep
‑
2负链：5
’‑
AGCTTAAAAAAGCCTAATCGTCGAGACGCAACGTGAT CCCATCTGTGG CTTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏凯，张树宇，申明月，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：