金银花肉桂酰辅酶A还原酶基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种金银花肉桂酰辅酶A还原酶基因及应用，属于金银花植株体内绿原酸代谢相关基因技术领域，银花肉桂酰辅酶A还原酶基因如SEQ ID NO.1所示，金银花肉桂酰辅酶A还原酶(LjCCR)基因是首次从金银花中克隆制备的，体外实验表明，LjCCR具有催化香豆酰辅酶A转化成香豆醛的活性，利用本发明专利技术可以通过基因工程技术来稳定金银花等植物中绿原酸的含量。技术来稳定金银花等植物中绿原酸的含量。技术来稳定金银花等植物中绿原酸的含量。

【技术实现步骤摘要】
金银花肉桂酰辅酶A还原酶基因及应用


[0001]本专利技术涉及金银花植株体内绿原酸代谢相关基因
，更具体地说是涉及金银花肉桂酰辅酶A还原酶基因及应用。

技术介绍

[0002]银花(Lonicerajaponica Thunb.)又名忍冬，为忍冬科忍冬属植物，是亚洲国家广泛使用的一种药用植物。金银花具有抑菌、抗病毒、解热、止血、抗氧化、降血脂、免疫调节等作用，常用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病发热等症。目前已从金银花中发现200多种化合物，绿原酸(chlorogenic acids)是金银花的主要药效成分，其具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性。2020版药典规定，金银花为忍冬(L.japonica)的干燥花蕾或带初开的花，绿原酸含量不得少于1.5％。金银花不仅由于品种差异导致绿原酸含量差异较大，而且由于受环境因子影响，同一品种在同一时期不同地域、或是同一地域不同年份其绿原酸含量变化较大，正品金银花常常容易被误判为伪品。因此，有效提高和稳定绿原酸含量是金银花育种和栽培中面临的重大难题。
[0003]绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，苯丙氨酸解氨酶(PAL)，肉桂酸
‑4‑
羟化酶(C4H)与4
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羟基桂皮酰辅酶A连接酶(4CL)是最初三步反应的关键酶。已有研究表明，在这三种酶的作用下，苯丙氨酸转化为肉桂酸，后者再转化生成香豆酰辅酶A，此后主要途径有两条：第一条是香豆酰奎宁酸途径，香豆酰奎宁酸在香豆酸羟基化酶CQT(p
‑
coumarate 3
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hydroxylase)的作用下生成绿原酸；第二条途径是香豆酰莽草酸途径，香豆酰莽草酸在CQT作用下生成咖啡酸莽草酸，继而在羟基化肉桂酰辅酶A/奎宁酸羟化肉桂酰基转移酶(HQT)作用下酯化生成绿原酸，可看出CQT在两条途径中都起着重要的作用。已有研究表明，在这三种酶的作用下，苯丙氨酸转化为肉桂酸，后者再转化生成香豆酰辅酶A，此后主要途径有两条：第一条是香豆酰奎宁酸途径，香豆酰奎宁酸在香豆酸羟基化酶CQT(p
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coumarate 3
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hydroxylase)的作用下生成绿原酸；第二条途径是香豆酰莽草酸途径，香豆酰莽草酸在CQT作用下生成咖啡酸莽草酸，继而在羟基化肉桂酰辅酶A/奎宁酸羟化肉桂酰基转移酶(HQT)作用下酯化生成绿原酸。但是香豆酰辅酶A在肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)基因作用下可转化成香豆醛；咖啡酰辅酶A在肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)基因作用下可转化成咖啡醛；阿魏酰辅酶A在肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)基因作用下可转化成松柏醛，因此，金银花肉桂酰辅酶A还原酶(LjCCR)基因及其编码产物也是绿原酸生物合成的关键酶。金银花肉桂酰辅酶A还原酶(LjCCR)基因的克隆，将为利用基因工程稳定金银花绿原酸含量提供重要基础。
[0004]因此，如何开发金银花肉桂酰辅酶A还原酶LjCCR基因的新用途是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了金银花肉桂酰辅酶A还原酶基因及应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种金银花肉桂酰辅酶A还原酶基因，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交且编码所述银花肉桂酰辅酶A还原酶的DNA分子；或，与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有90％以上的同一性且编码银花肉桂酰辅酶A还原酶的DNA分子；或由SEQ ID NO.1所示的序列通过取代、缺失或增加核苷酸而获得的序列；或由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列产生不同的转录本或者同源基因序列。
[0009]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护所述的基因序列在调控金银花绿原酸代谢中的应用。
[0010]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护如SEQ ID NO.2所示的蛋白质序列。
[0011]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护与SEQ ID NO.2所示的序列具有相同功能，且通过取代缺失或增加一个或多个氨基酸而获得的序列；或，与SEQ ID NO.2所示的序列具有相同功能，且N端或C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0012]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护包含SEQ IDNO.1所示序列的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞。
[0013]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞在调控金银花绿原酸代谢中的应用。
[0014]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种调控植物绿原酸代谢的方法，包括将所示的序列转化至植物中以使其在植物中表达。
[0015]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术所提供的金银花肉桂酰辅酶A还原酶(LjCCR)基因是首次从金银花中克隆制备的，体外实验表明，LjCCR具有催化香豆酰辅酶A转化成香豆醛的活性，利用本专利技术可以通过基因工程技术来稳定金银花等植物中绿原酸的含量。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0017]图1附图为LjCCR基因原核表达载体；
[0018]图2附图为香豆酰辅酶A中加入LjCCR蛋白后成分检测；
[0019]图3附图为金银花悬浮细胞中LjCCR基因RT
‑
PCR检测；
[0020]图4附图为金银花转LjCCR基因愈伤与未转基因愈伤。
具体实施方式
[0021]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他
实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0022]实施例1金银花全长cDNA文库的构建
[0023]金银花总RNA的分离和检测
[0024]第一步实验材料准备:将量筒(10ml，50ml)、刀片、镊子、研钵和杵在160℃下烘烤过夜。将以下物品浸泡在0.1％v/v DEPC水中(1ml DEPC:999ml dH2O)过夜：13ml管、移液管尖端、微量离心管(1.5ml)、15
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50ml锥形瓶、磁力搅拌棒，121℃灭菌30min。准备DEPC处理水：在1L瓶中，将1ml DEPC加入999ml超纯水中，在37℃下搅拌溶液两小时或在室温下搅拌过夜，1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种金银花肉桂酰辅酶A还原酶基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。2.与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交且编码所述银花肉桂酰辅酶A还原酶的DNA分子；或，与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有90％以上的同一性且编码银花肉桂酰辅酶A还原酶的DNA分子；或由SEQ ID NO.1所示的序列通过取代、缺失或增加核苷酸而获得的序列；或由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列产生不同的转录本或者同源基因序列。3.权利要求1或2所述的基因序列在调控金银花绿原酸代谢中的应用。4.权利要求1所述的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋向辉，刘卫今，杨莉君，
申请(专利权)人：怀化学院，
类型：发明
国别省市：