检测17α羟化酶缺乏症相关基因CYP17A1全外显子序列突变的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测17α羟化酶缺乏症相关基因CYP17A1全外显子序列突变的引物、试剂盒及方法，属于基因检测技术领域。本发明专利技术提供的特异性引物包括扩增覆盖CYP17A1基因的全部8个外显子的正、反向引物，对样本进行PCR反应，最后利用Sanger测序法对序列进行测序。本发明专利技术提供的用于检测17α羟化酶缺乏症相关基因CYP17A1外显子序列突变的方法可覆盖待检测的所有突变位点，具有高效、简便、灵敏度高等特点，极大地降低了检测成本；可辅助临床上对17α羟化酶缺乏症的诊断，提高诊断效率，有效监测17α羟化酶缺乏症的发生和发展。测17α羟化酶缺乏症的发生和发展。测17α羟化酶缺乏症的发生和发展。

【技术实现步骤摘要】
检测17
α
羟化酶缺乏症相关基因CYP17A1全外显子序列突变的引物、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，特别是涉及检测17α羟化酶缺乏症相关基因CYP17A1基因全部8个外显子序列突变的引物、试剂盒以及方法。

技术介绍

[0002]17α
‑
羟化酶/17，20裂解酶缺乏症是一种罕见的先天性肾上腺增生症，是由细胞色素P450 17A1(CYP17A1)基因突变引起的常染色体隐性遗传病，占所有先天性肾上腺增生症的1/10，其中新生儿的发病率为1/5000
‑
1/10000。
[0003]CYP17A1基因位于10q24.3，全长6.6kb，包含8个外显子，它编码细胞色素P450超家族的一种酶P450c17，可催化17α
‑
羟化酶反应生成17
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羟基类固醇，并通过17,20裂解酶反应将21
‑
碳的17
‑
羟基类固醇裂解成19
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碳的17
‑
酮雄激素前体。因此当17α
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羟化酶/17,20裂解酶功能缺陷时会导致糖皮质激素和性类固醇的缺乏，垂体会通过负反馈作用分泌促肾上腺皮质激素(ACTH)，使得类固醇前体和ACTH水平升高，从而导致双侧肾上腺增生，出现高血压、低钾血等表现以及抑制肾素活性，使醛固酮合成下降，临床上主要表现为低肾素、低醛固酮性高血压，低血钾。另外，性激素的不足或缺乏会导致46，XX女性第二性征不发育，表现为性幼稚、原发性闭经，青春期发育不足；在46，XY男性患者，使外生殖器男性化不足，表现为盲端阴道，呈现男性假两性畸形。
[0004]文献报道的CYP17A1基因突变超过70种，约1/3为替代突变，其次为小的片段缺失(<＝20bp)和小片段的重复序列插入，也有少数的复合杂合突变。有研究表明CYP17A1不同突变体的17α
‑
羟化酶/17,20裂解酶活性存在差异；具有相同CYP17A1基因型的个体之间，其表型例如高血压的程度可能存在差异；与完全丧失酶活性的突变相比，保留部分酶活性的突变的临床症状往往较轻，后者个体的表型是高度可变的。临床上对于17α
‑
羟化酶缺乏症的诊断手段的传统方法主要依靠影像学和生化检查，但这些手段都存在很大的缺陷，例如检查过程繁琐，检查的灵敏度以及特异性低，检查结果易受药物、患者精神状况、时间等影响；但基因突变检测不受限制，任何时间均可进行检测，这极大提高了检测时间和效率，这有利于临床上更加快速、高效地结合患者表现症状来研究和判断病情，因此对患者CYP17A1基因进行检测分析是十分有必要的。
[0005]目前用于CYP17A1基因突变检测的主要方法有Taqman法、质谱法、芯片法等。Taqman法检测灵敏度高适用于大样本、少位点，价格较高；质谱法准确性也较高但适用于大样本，多位点检测；芯片法准确度较低适用于超多位点检测。质谱法和芯片法都需配备价格昂贵的大型仪器设备，实验条件要求高，导致检测成本提升。
[0006]因此，本领域需提供一种可以快速、有效且准确的检测基因CYP17A1全外显子序列，Sanger测序法对此非常适用，该法原理简单，成本低廉，同时适用于少样本多位点检测且该技术已经相当成熟。

技术实现思路

[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供一组用于检测17α羟化酶缺乏症相关基因CYP17A1外显子序列突变的特异性引物，该组PCR特异性正、反向引物，分别为：
[0008]用于扩增CYP17A1基因第1外显子的正、反向引物，其核苷酸序列为：
[0009]CYP17A1
‑
E1
‑
F：CTCCAGGAGAATCTTTCCACAA
[0010]CYP17A1
‑
E1
‑
R：TCTGAAGACCTGAACAATCCCA
[0011](目的片段长度为510bp)
[0012]用于扩增CYP17A1基因第2外显子的正、反向引物，其核苷酸序列为：
[0013]CYP17A1
‑
E2
‑
F：GATTCCTACAGCCTTGCCTGC
[0014]CYP17A1
‑
E2
‑
R：CATTGCGCTCTAGTCCTAACC
[0015](目的片段长度为272bp)
[0016]用于扩增CYP17A1基因第3外显子的正、反向引物，其核苷酸序列为：
[0017]CYP17A1
‑
E3
‑
F：AGAGGCAACTGGTACAGAGAG
[0018]CYP17A1
‑
E3
‑
R：GGAAGATTGGGGACAATGTCAG
[0019](目的片段长度为364bp)
[0020]用于扩增CYP17A1基因第4外显子的正、反向引物，其核苷酸序列为：
[0021]CYP17A1
‑
E4
‑
F：AGACAGAAAGCTAAGATCCGCC
[0022]CYP17A1
‑
E4
‑
R：GAATGGACTCCACCCTGCTCT
[0023](目的片段长度为253bp)
[0024]用于扩增CYP17A1基因第5外显子的正、反向引物，其核苷酸序列为：
[0025]CYP17A1
‑
E5
‑
F：GTATGGCAGGAGTGTCACAGAT
[0026]CYP17A1
‑
E5
‑
R：AACTACTGCTTGGGTAAGGAGC
[0027](目的片段长度为416bp)
[0028]用于扩增CYP17A1基因第6外显子的正、反向引物，其核苷酸序列为：
[0029]CYP17A1
‑
E6
‑
F：ACCTCCAACCTACTCTGGTCT
[0030]CYP17A1
‑
E6
‑
R：TGAATGCATCATGGGGCTAGAT
[0031](目的片段长度为239bp)
[0032]用于扩增CYP17A1基因第7外显子的正、反向引物，其核苷酸序列为：
[0033]CYP17A1
‑
E7
‑
F：GGCTGAGCAAGGAAGGGAGT
[0034]CYP17A1
‑
E7
‑
R：CCGTATAGTTGGAGCCAAGAGTT
[0035](目的片段长度为288bp)
[0036]用于扩增CYP17A1基因第8号外显子的正、反向引物，其核苷酸序列为：
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组用于检测17α羟化酶缺乏症相关基因CYP17A1全外显子序列突变的特异性引物，其特征在于，包括扩增覆盖CYP17A1基因全部8个外显子的正、反向引物，其核苷酸序列为：CYP17A1
‑
E1
‑
F：CTCCAGGAGAATCTTTCCACAACYP17A1
‑
E1
‑
R：TCTGAAGACCTGAACAATCCCACYP17A1
‑
E2
‑
F：GATTCCTACAGCCTTGCCTGCCYP17A1
‑
E2
‑
R：CATTGCGCTCTAGTCCTAACCCYP17A1
‑
E3
‑
F：AGAGGCAACTGGTACAGAGAGCYP17A1
‑
E3
‑
R：GGAAGATTGGGGACAATGTCAGCYP17A1
‑
E4
‑
F：AGACAGAAAGCTAAGATCCGCCCYP17A1
‑
E4
‑
R：GAATGGACTCCACCCTGCTCTCYP17A1
‑
E5
‑
F：GTATGGCAGGAGTGTCACAGATCYP17A1
‑
E5
‑
R：AACTACTGCTTGGGTAAGGAGCCYP17A1
‑
E6
‑
F：ACCTCCAACCTACTCTGGTCTCYP17A1
‑
E6
‑
R：TGAATGCATCATGGGGCTAGATCYP17A1
‑
E7
‑
F：GGCTGAGCAAGGAAGGGAGTCYP17A1
‑
E7
‑
R：CCGTATAGTTGGAGCCAAGAGTTCYP17A1
‑
E8
‑
F：ACCAGGGCAGAACCATGCCYP17A1
‑
E8
‑
R：AGGTGCTCAATAAAATCGGTG。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，当测序引物采用M13F和M13R时，在上述上游引物的5
’
端连接有TGTAAAACGACGGCCAGT，在上述下游引物5
’
端连接有AACAGCTATGACCATG。3.一种检测17α羟化酶缺乏症相关基因CYP17A1全外显子序列突变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括样本DNA提取试剂、PCR扩增反应试剂、测序体系反应液、阴性对照，其中PCR扩增反应试剂还包括权利要求1所述的一组扩增覆盖CYP17A1基因全部8个外显子正、反向引物，其核苷酸序列为：CYP17A1
‑
E1
‑
F：CTCCAGGAGAATCTTTCCACAACYP17A1
‑
E1
‑
R：TCTGAAGACCTGAACAATCCCACYP17A1
‑
E2
‑
F：GATTCCTACAGCCTTGCCTGCCYP17A1
‑
E2
‑
R：CATTGCGCTCTAGTCCTAACCCYP17A1
‑
E3
‑
F：AGAGGCAACTGGTACAGAGAGCYP17A1
‑
E3
‑
R：GGAAGATTGGGGACAATGTCAGCYP17A1
‑
E4
‑
F：AGACAGAAAGCTAAGATCCGCCCYP17A1
‑
E4
‑
R：GAATGGACTCCACCCTGCTCTCYP17A1
‑
E5
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F：GTATGGCAGGAGTGTCACAGATCYP17A1
‑
E5
‑
R：AACTACTGCTTGGGTAAGGAGCCYP17A1
‑
E6
‑
F：ACCTCCAACCTACTCTGGTCTCYP17A1
‑
E6
‑
R：TGAATGCATCATGGGGCTAGATCYP17A1
‑
E7
...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡嘉慧，王淑一，袁势超，
申请(专利权)人：济南艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：