一种基于量子点标记抗体用于质谱流式检测的样本编码试剂及其制备与检测和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于量子点标记抗体的用于质谱流式检测的样本编码试剂，所述样本编码试剂选用含有不同Cd或者In元素的量子点偶联CD44抗体或CD11a抗体，用于对不同样本的白细胞进行编码和混合检测。本发明专利技术还提供了基于量子点标记抗体用于质谱流式检测的样本编码试剂的制备与检测方法，包括样本编码、抗体染色、上机检测、解码和数据分析等步骤。可以在质谱流式分析细胞的通道基础上，替代CD45抗体，通过编码检测更多的样本，简化了操作流程，提高了检测的效率。同时，通过多样本的混合检测，减少样本间检测的误差，提升了准确性，有较好的临床应用前景。的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于量子点标记抗体用于质谱流式检测的样本编码试剂及其制备与检测和应用


[0001]本专利技术设及医疗器械，具体涉及检测试剂，尤其涉及一种基于量子点标记抗体的用于质谱流式检测的样本编码试剂及其制备与检测和应用。

技术介绍

[0002]质谱流式细胞技术(Mass Cytometry)是在荧光流式细胞技术的基础上利用质谱技术对单细胞进行多参数检测的流式技术。继承了传统荧光流式的高速分析的特点，又结合了质谱检测的高分辨能力，能有效避免荧光光谱重叠带来的窜色问题，且没有荧光通道数的限制，从而大幅提升检测的通道数，目前同时检测多达50个参数。在单细胞水平上对细胞进行精细地表面标志物分析和功能分析在免疫学和细胞生物学领域越来越重要，质谱流式技术就是近年发展起来的一种新型高效的单细胞分析技术。
[0003]质谱流式细胞技术实现了对单细胞进行多种蛋白及分泌因子的检测，可以用来对细胞亚群进行更精细的免疫分型，通过检测机体内各类免疫细胞数量和形态功能的变化，可以对疾病的个体化治疗提供更精准的数据支持。
[0004]样本编码技术(Barcoding)是在传统荧光流式分析过程中使用的一种新型技术。其原理是使用多种荧光基团标记，通过荧光的不同浓度对样本细胞进行编码，有效解决了荧光流式技术检测通道少的困扰，提高了检测效率，同时也能解决检测批次间差异的问题。样本编码技术也被应用于质谱流式细胞技术，可以极大的降低质谱流式技术批次间差异，有效避免样品前处理及仪器稳定性对试验产生干扰，增加现有金属通道，减少抗体试剂的损耗，避免多批次操作所造成的有效细胞的损失，缩短大批量临床样本的检测时间进而提高检测的效率。目前较为常用的样本编码试剂包括：一是分别使用不同金属标签的CD45抗体对不同样本进行编码。CD45是细胞分析中常用的一种白细胞共同抗原，广泛存在于白细胞表面，是白细胞亚群的分类标志；二是分别使用钯金属(Pd)的不同同位素标签对不同样本进行编码。例如美国富鲁达公司的Cell
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ID产品，质量不同的钯金属同位素可以偶联到细胞的生物分子上，从而实现对不同样本的标记和编码。
[0005]量子点(QD)是一类球形或类球形的微粒，通常直径在10nm以内，可以由II
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VI族元素(如硫化镉CdS、硒化镉CdSe、碲化镉CdTe、硒化锌ZnSe等和III
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V族元素(如磷化铟InP、砷化铟InAs等的化合物组成；也可以由两种或两种以上的上述材料组成核壳结构。由于量子点独特的光物理和光化学性质，可以作为荧光探针被广泛的用于生物医药研究领域，例如量子点标记的抗体可以用于流式细胞术。同时由于量子点的关键组成成分由镉或铟等金属组成，可以通过使用包括质谱流式在内的元素分析方法对不同金属组成的量子点进行鉴定和分析。由于现有CD45抗体所标记的抗体仅限于镧系金属及其同位素，数量有限从而限制了其使用范围。另一方面，由于钯金属的同位素数量有限，能够使用不同钯金属进行组合编码的种类仍然受到限制，尚无法满足现有的应用需求。部分钯金属同位素成本昂贵，例如Pd
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102，大幅增加了使用成本。需要新的样本编码技术，扩大其使用范围。
[0006]CD45抗体广泛存在于白细胞表面，是白细胞亚群的分类标志。因此，在用作多个样本的白细胞亚群分析的时候，荧光或者金属元素编码的CD45抗体被广泛的用作样本编码用试剂。但是由于CD45抗体本身是细胞亚群分析用抗体组合的核心抗体。当CD45抗体额外用于样本的编码时，会与现有的含有CD45抗体的抗体组合试剂冲突，限制了其应用。目前缺少替代CD45抗体的编码用试剂。CD44是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，在淋巴细胞，成纤维细胞表面均能检测到它的表达。作为一种黏附分子，CD44蛋白的正常功能是作为受体识别透明质酸(HA)和胶原蛋白Ⅰ、Ⅳ等，主要参与细胞
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细胞，细胞
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基质之间的特异性粘连过程。类似于CD45在淋巴细胞中的广泛表达，使用CD44抗体也可以标记几乎所有淋巴细胞和成纤维细胞等。
[0007]CD11a又称LFA
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1a或整合素aL链，在所有白细胞上均有表达，包括淋巴细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞等。CD11a属于整合素家族。由于其广泛表达，使用CD11a也可以标记几乎所有淋巴细胞。因此，如何使用金属元素编码的CD44抗体和CD11a抗体，替代目前所用的金属元素编码的CD45抗体，实现多样本同时分析是极具有现实意义的。

技术实现思路

[0008]本专利技术所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计采用含有不同Cd或者In元素的量子点偶联CD44抗体和CD11a抗体，对不同样本的白细胞进行编码和混合的检测试剂。
[0009]本专利技术提供一种基于量子点标记抗体用于质谱流式检测的样本编码试剂及其制备与检测和应用。
[0010]本专利技术提供一种基于量子点标记抗体的用于质谱流式检测的样本编码试剂，所述编码试剂选用含有不同Cd或者In元素的量子点偶联CD44抗体或CD11a抗体，用于对不同样本的白细胞进行编码和混合检测。
[0011]本专利技术所述量子点标记抗体为CD44抗体(CD44
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QD)或CD11a抗体(CD11a
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QD)。
[0012]本专利技术所述的量子点是羧基修饰的水溶性量子点。该量子点可以均匀的分散于水溶液中，表面羧基具有反应活性。通过该羧基可以与富含氨基的生物分子(蛋白质、抗体、核酸等)共价偶联。量子点表面的羧基在活化剂1
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(3
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二甲氨基丙基)
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乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)作用下，与氨基反应形成稳定的酰胺键，从而实现对生物分子的量子点标记。
[0013]本专利技术所述量子点抗体，优选羧基修饰的高质量的CdSe/ZnS量子点和InP量子点(见图1)。CdSe/ZnS量子点和InP量子点通过图1所述反应所形成的酰胺键与抗体偶联在一起。
[0014]所述Cd量子点抗体上所含的Cd元素选自同位素Cd106、Cd108、Cd110、Cd111、Cd112、Cd113、Cd114、Cd116或所述Cd同位素的混合物；
[0015]所述In量子点抗体上所含的In元素选自同位素In113、In115或所述In同位素的混合物。
[0016]本专利技术的另一目的是提供了基于量子点标记抗体用于质谱流式检测的样本编码试剂的制备与检测方法，包括样本编码、抗体染色、上机检测、解码和数据分析等步骤。
[0017]具体的，该方法包括下列步骤：
[0018](一)Cd同位素和In同位素量子点标记CD44抗体(CD44
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QD)或CD11a抗体(CD11a
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QD)的制备，该方法包括下列步骤：
[0019]取羧基修饰的量子点溶液(原料来源昆道生物)0.5～5毫克，分散于适量反应缓冲液(25mM，pH 6.0磷酸盐缓冲液)中，混匀，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于量子点标记抗体的用于质谱流式检测的样本编码试剂，其特征在于，所述样本编码试剂选用含有不同Cd或者In元素的量子点偶联CD44抗体或CD11a抗体。2.根据权利要求1所述一种基于量子点标记抗体的用于质谱流式检测的样本编码试剂，其特征在于，所述量子点标记抗体为CD44抗体或CD11a抗体。3.根据权利要求1所述一种基于量子点标记抗体的用于质谱流式检测的样本编码试剂，其特征在于，所述Cd量子点抗体上所含的Cd元素选自同位素Cd106、Cd108、Cd110、Cd111、Cd112、Cd113、Cd114或Cd116中的一种或几种混合物。4.根据权利要求1所述一种基于量子点标记抗体的用于质谱流式检测的样本编码试剂，其特征在于，所述量子点抗体上所含的In元素选自同位素In113或In115或二者的混合物。5.一种基于量子点标记抗体用于质谱流式检测的样本编码试剂的制备与检测方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：(一)Cd同位素和In同位素量子点标记CD44抗体或CD11a抗体的制备，该方法包括下列步骤：取羧基修饰的量子点溶液0.5～5毫克，分散于25mM，pH 6.0磷酸盐缓冲液中，混匀，加入0.1～1mmol/L EDC溶液，恒温25
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37度混匀孵育30分钟，结束后，加入浓度为50～500ug/ml的CD44抗体或CD11a抗体，混匀，恒温25
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37度混匀孵育30分钟，结束后，12000
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15000rpm离心10分钟，去上清后，加浓度为1～10mg/ml牛血清白蛋白封闭2小时后置于4℃保存，得到CD44
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QD或CD11a
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QD溶液，用于后续的实验；(二)使用Cd同位素和In同位素量子点标记CD44抗体或CD11a抗体编码试剂进行样本编码的制备：步骤(一)所述有同位素量子点标记的CD44
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QD或CD11a溶液，对每一样本分别任选1
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4种样本进行编码，得到编码试剂；(三)将上述样本进行混合后，再进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅健，陈亚楠，孙双午，王宇翀，
申请(专利权)人：上海宸安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：