一种重组鸡干扰素α蛋白、其制备方法及应用技术

本发明专利技术公开一种重组鸡干扰素α蛋白、其制备方法及应用，属于蛋白融合技术领域。本发明专利技术提供的重组鸡干扰素α蛋白，由鸡干扰素α和白蛋白融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术所制备的重组鸡干扰素α蛋白，延长了鸡天然干扰素α的半衰期，减少了用药次数，解决了现有干扰素半衰期短和用药次数多、应用成本高等问题，既能够节约应用成本，还能够减少人工操作次数。此外，本发明专利技术通过温度诱导即可实现重组蛋白的表达，避免了诱导剂的使用，也节约了生产成本。也节约了生产成本。也节约了生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种重组鸡干扰素
α
蛋白、其制备方法及应用


[0001]本专利技术属于蛋白融合
，具体涉及一种重组鸡干扰素α蛋白、其制备方法及应用。

技术介绍

[0002]当前对养鸡业危害最大的疾病是传染病，尤其是传染病中的病毒病，给养殖业造成了严重的经济损失。农业部早在2005年禁用了利巴韦林、金刚烷胺等抗病毒类化药在养殖业中的使用，从而使得西药受到较大的应用限制。病毒性传染病目前主要依靠疫苗来预防，然而，养殖现场病原复杂，难以对鸡群形成完全保护，如新城疫、禽流感、鸡传染性支气管炎、马立克氏病等传染性病毒疾病时有发生，给养殖业带来严重威胁。
[0003]干扰素(Interferon，IFN)是一类能诱导动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子，具有抑制病毒繁殖、调节机体免疫和抗肿瘤的功能。IFN基因分为I型和Ⅱ型，I型IFN又分为α和β等型。干扰素α(IFN
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α)是机体免疫细胞产生的一种细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的低分子糖蛋白。干扰素在机体的免疫系统中起着非常重要的作用。近年来，采用基因工程技术制备干扰素的报道较多，但真正实现产业化的目前获批的只有犬的干扰素，原因主要是对养殖动物的应用成本高等问题是影响产业化的关键因素。同时无论天然干扰素或重组干扰素普遍存在半衰期短，给药次数多，增加应用成本和人工成本等问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在通过构建鸡干扰素α与白蛋白的融合基因，并克隆至表达载体上，通过温度诱导实现重组融合蛋白的表达，从而延长鸡天然干扰素α的半衰期，减少了用药次数，节约表达所用诱导剂的生产成本。
[0005]本专利技术的技术方案如下：
[0006]本专利技术提供了一种重组鸡干扰素α蛋白，由鸡干扰素α和白蛋白融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]上述重组鸡干扰素α蛋白的表达基因，如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本专利技术提供了一种含有上述重组鸡干扰素α蛋白表达基因的重组表达载体。优选地，所述重组表达载体为含有重组鸡干扰素α蛋白表达基因的pBV220载体。
[0009]本专利技术还提供了一种含有上述重组鸡干扰素α蛋白表达基因的重组菌。优选地，所述重组菌为含有重组鸡干扰素α蛋白表达基因的大肠杆菌。
[0010]本专利技术提供了上述重组鸡干扰素α蛋白的制备方法，步骤如下：将上述重组鸡干扰素α蛋白表达基因构建到表达载体中，形成重组表达载体；将重组表达载体转化大肠杆菌，获得含有重组鸡干扰素α蛋白表达基因的重组菌；利用温度诱导重组菌表达，经纯化后获得重组鸡干扰素α蛋白。
[0011]在上述制备方法中，诱导温度选自41～42℃。优选地，诱导温度为42℃。
[0012]上述利用温度诱导重组菌表达的具体方法为：将重组菌在含氨苄青霉素的LB培养基中培养，培养温度为30～32℃，待OD值为0.6时，将培养温度升至41～42℃，诱导培养4～6h，诱导重组菌表达。
[0013]本专利技术提供了上述重组鸡干扰素α蛋白在制备具有广谱抗病毒作用的制剂中的应用。
[0014]本专利技术提供了一种鸡用干扰素制剂，含有上述重组鸡干扰素α蛋白；该制剂还优选地包含有其它药学上可接受的佐剂，例如效价稳定保护剂等。
[0015]本专利技术的有益效果为：
[0016]本专利技术所制备的重组鸡干扰素α蛋白，延长了鸡天然干扰素α的半衰期，减少了用药次数，解决了现有干扰素半衰期短和用药次数多、应用成本高等问题，既能够节约应用成本，还能够减少人工操作次数。此外，本专利技术通过温度诱导即可实现重组蛋白的表达，避免了诱导剂的使用，也节约了生产成本。
附图说明
[0017]图1为重组质粒的双酶切鉴定电泳图；其中，泳道M：DNA Marker DL10000；泳道1：重组质粒双酶切电泳条带，其中，上方条带为载体片段，大小为3600bp；下方条带为融合基因片段，大小为2349bp；
[0018]图2为SDS
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PAGE电泳检测结果；其中，泳道M：蛋白Marker；泳道1：未进行42℃诱导的空菌菌体；泳道2：42℃诱导后空菌菌体；泳道3：重组菌未进行42℃诱导的菌体破碎后全菌，泳道4：重组菌在42℃诱导5h后的菌体破碎后全菌；
[0019]图3为重组蛋白Western Blot鉴定结果；其中，泳道1：空菌对照；泳道2：重组菌诱导破碎后全菌；泳道3：重组菌诱导破碎后沉淀。
具体实施方式
[0020]在本专利技术中，目的基因设计、合成，重组表达载体的构建，重组菌的构建，均可通过常规技术手段实现。本专利技术中所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本专利技术。以下实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。
[0021]实施例1
[0022]重组蛋白的制备：
[0023](1)设计与合成目的基因
[0024]按照鸡干扰素α基因
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连接肽
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白蛋白的基因顺序设计重组蛋白基因，并在基因两端分别加上BamHI和SalI两个酶切位点，形成目的基因。将设计好的目的基因后交由生工生物工程(上海)股份有限公司直接合成。目的基因的序列如下所示：
[0025]SEQ ID NO:1：
[0026][0027][0028]上述目的基因的表达蛋白，其氨基酸序列如下所示：
[0029]SEQ ID NO:2：
[0030][0031](2)构建重组表达载体及重组菌
[0032]将pBV220载体利用BamHI/SalI双酶切，回收后，与目的基因进行连接，并转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基平板培养过夜，取LB平板上生长的单菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒行双酶切鉴定，鉴定为阳性者
表示表达载体构建成功。如图1所示，重组表达载体构建成功。
[0033](3)温度诱导重组菌表达与鉴定
[0034]挑取以上鉴定为阳性克隆的重组菌落，划线于含氨苄青霉素的LB培养基平板培养过夜后，挑取单菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养，测OD值在0.6左右时，将培养温度由32℃升至42℃，继续诱导培养5h，收集细菌。
[0035]在上述表达方法的基础上，设置如下对照：Ⅰ.对空菌菌体不进行42℃诱导；Ⅱ.对空菌菌体进行42℃诱导；Ⅲ.对重组菌不进行42℃诱导。
[0036]经SDS
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PAGE电泳检测，如图2所示，与空菌相比，重组菌在87KD左右有一条浓染的新增蛋白条带，这表明，通过温度诱导，可促使重组菌成功表达重组干扰素α蛋白。
[0037]以鼠抗鸡α干扰素(1:3500稀释)为一抗，以山羊抗小鼠IgG
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HRP(1:5000稀本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组鸡干扰素α蛋白，其特征在于，由鸡干扰素α和白蛋白融合而成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.权利要求1所述重组鸡干扰素α蛋白的表达基因如SEQ ID NO:1所示。3.一种含有权利要求2所述重组鸡干扰素α蛋白表达基因的重组表达载体。4.一种含有权利要求2所述重组鸡干扰素α蛋白表达基因的重组菌。5.权利要求1所述重组鸡干扰素α蛋白的制备方法，其特征在于，步骤如下：将重组鸡干扰素α蛋白表达基因构建到表达载体中，形成重组表达载体；将重组表达载体转化大肠杆菌，获得含有重组鸡干扰素α蛋白表达基因的重组菌；利用温度诱导重组菌表达，经纯化后获得重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凤华，彭大鹏，汪安国，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：