一种黑曲霉碱基编辑体系及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种黑曲霉碱基编辑体系及其构建方法与应用。本发明专利技术采用碱基编辑系统中的胞嘧啶脱氨酶(AID)在黑曲霉中的编辑效率明显高于BEC系统中的使用大鼠胞苷脱氨酶(rAPOBEC1)，在以相同的靶标基因(黑曲霉中AnpyrG基因An12g03570中相同20bp的protospacer序列)编辑时，AID系统编辑效率为93.8％，BEC系统为43.8％，编辑效率提高了一倍以上，进一步提高了在黑曲霉中碱基编辑系统的效率Target

【技术实现步骤摘要】
一种黑曲霉碱基编辑体系及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程技术应用领域，主要涉及一种黑曲霉碱基编辑体系及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas的基因编辑系统通过Cas核酸酶进行基因破坏及遗传修饰，可以精确的在靶标位置诱导DNA双链断裂(DSBs)。DSBs可以通过多种修复机制进行修复：包括细胞自身发生非同源性末端连接(NHEJ)以介导随机插入或缺失；以细胞自身或添加同源DNA进行同源重组修复(HDR)。碱基编辑器(BE)是可在基因组DNA靶标处进行精确的核苷酸突变，而无需DSBs，DNA供体模板的递送或依赖HDR和NHEJ。因为碱基编辑不诱导DSBs，它可以最大限度地减少由DSBs产生的DNA损伤和NHEJ产生的不良随机突变插入。
[0003]碱基编辑器主要由失去核酸酶活性的Cas9(dcas9)或切口酶Cas9(nCas9)和脱氨酶组成。例如，Komor等人开发的第三代碱基编辑器BE3是由大鼠APOBEC1(rAPOBEC1)，nCas9和尿嘧啶糖基酶抑制剂(UGI)组成的融合蛋白。单导RNA(sgRNA)由20
‑
bp原间隔序列组成，该序列通过碱基配对识别靶位点和下游sgRNA支架序列。靶DNA包含20
‑
bp靶序列，后跟必需的3
‑
bp原间隔相邻基序(PAM)5'
‑
NGG。成熟的sgRNA引导nCas9到特异性20nt基因组位点，然后nCas9在PAM上游的靶DNA处引入单链断裂。在BE3与由sgRNA介导的靶位点结合后，rAPOBEC1将靶向胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，UGI抑制DNA糖苷酶去除U，随后通过DNA复制或修复，将尿嘧啶(U)转化为胸腺嘧啶(T)。
[0004]黑曲霉由于其天然高分泌能力长期以来被用于工业生产，包括生产同源和异源蛋白的表达。基因工程技术的不断提高使微生物育种能够从传统方法随机诱变到定向改造。尽管丝状真菌的基因组编辑工具CRISPR/Cas9大大提高了丝状真菌的改造效率，然而在遗传改造过程中，为了提高目的基因插入的同源重组概率，需要通过敲除Ku70/Ku80基因来消除非同源末端连接的修复机制。丝状真菌在敲除Ku70/Ku80后，通过CRISPR/Cas9敲除基因时，往往需要引入供体DNA以防止Cas9切割而导致基因组双链断裂(DSBs)后菌体无法正常生长。黄良刚等人首次在丝状真菌中构建了BEC系统并实现了pyrG、fwnA、prtT基因的碱基点突变。但在丝状真菌中BEC系统仍存在一定应用限制，如某些基因位点的编辑效率不高，编辑时受限于PAM位点而无法在目标基因序列实现碱基突变。因此，进一步优化丝状真菌的碱基编辑系统，对丝状真菌的遗传改造具有重要意义。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的缺点与不足，进一步优化丝状真菌的碱基编辑系统，本专利技术的首要目的是提供了一种黑曲霉碱基编辑体系，克服了丝状真菌中BEC系统由于PAM(5'
‑
NGG)受限及编辑器的编辑效率低问题。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种黑曲霉碱基编辑体系的构建方法，该胞嘧啶碱基编辑系统包括胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖苷酶抑制剂和nCas9(NGG、NGN、NRY)的融合蛋白。
连接，得到黑曲霉碱基编辑体系Target
‑
AID
‑
NRY载体。
[0033]步骤(2)所述的获得片段的方法为使用引物进行PCR扩增；优选为使用引物332
‑
Ptef
‑
F和Ptef
‑
R扩增得到Ptef片段，使用引物AID
‑
link
‑
nCas
‑
F和Ptef
‑
R ncas9
‑
Ttef
‑
R扩增得到link
‑
nCas片段。
[0034]步骤(3)和步骤(6)所述的线性化为使用限制性内切酶PacI和PmlI双酶切。
[0035]步骤(3)和步骤(6)所述的连接为使用In
‑
fusion方法将DNA片段连接成环形质粒。
[0036]步骤(5)所述的获得SpG
‑
2、SpG
‑
3和SpG
‑
4片段的方法为使用引物进行PCR扩增；优选为使用引物332
‑
Ptef
‑
F和SpRY
‑2‑
R扩增得到SpG
‑
2片段，使用引物SpG\RY
‑3‑
F和SpG\RY
‑3‑
R扩增得到SpG
‑
3片段，使用引物SpG\RY
‑4‑
F和SpG\RY
‑4‑
R扩增得到SpG
‑
4片段。
[0037]步骤(5)所述的获得SpRY
‑
1、SpRY
‑
2、SpRY
‑
3和SpRY
‑
4片段的方法为使用引物进行PCR扩增；优选为使用引物332
‑
Ptef
‑
F和SpRY
‑1‑
R扩增得到SpRY
‑
1片段，使用引物SpG\RY
‑2‑
F和SpG\RY
‑2‑
F扩增得到SpRY
‑
2片段，使用引物SpG\RY
‑3‑
F和SpG\RY
‑3‑
R扩增得到SpRY
‑
3片段，使用引物SpG\RY
‑4‑
F和SpG\RY
‑4‑
R扩增得到SpRY
‑
4片段。
[0038]一种编辑黑曲霉碱基的方法，包括如下步骤：
[0039](1)设计并合成sgRNA序列；
[0040](2)将Target
‑
AID载体线性化，与sgRNA序列连接，转入大肠杆菌中，提取测序后得到sgRNA
‑
Target
‑
AID载体；
[0041](3)制备黑曲霉原生质体，将sgRNA
‑
Target
‑
AID载体转入原生质体，筛选得到转化子。
[0042]步骤(1)所述的sgRNA序列为能够识别特定protospacer序列的sgRNA；优选为U6启动子驱动的sgRNA。
[0043]步骤(2)所述的Target
‑
AID载体为Target
‑
AID
‑
NGG、Target
‑
AID
‑
NGN或Target
‑
AID
‑
NRY中的至少一种；优选为根据编辑位点的PAM序列，选择最合适的Target<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黑曲霉碱基编辑体系，其特征在于：包括将pFC332
‑
BEC质粒中的rAPOBEC1基因替换为AID基因得到的Target
‑
AID
‑
NGG质粒、将NGN部分突变序列构建到Target
‑
AID
‑
NGG质粒上的Target
‑
AID
‑
NGN质粒和将NRY部分突变序列构建到Target
‑
AID
‑
NGG质粒上的Target
‑
AID
‑
NRY质粒中的至少一种；所述的AID基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或其互补序列；所述的NGN部分突变序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或其互补序列；所述的NRY部分突变序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列或其互补序列。2.根据权利要求1所述的黑曲霉碱基编辑体系，其特征在于：所述的Target
‑
AID
‑
NGG质粒，能够识别PAM序列为NGG的编辑位点；所述的Target
‑
AID
‑
NGN质粒，是将NGN部分突变序列构建到nCas9基因上得到nCas
‑
NGN基因后得到的，能够识别PAM序列为NGN的编辑位点；所述的Target
‑
AID
‑
NRY质粒，是将NRY部分突变序列构建到nCas9基因上得到nCas
‑
NRY基因后得到的，能够更高效的识别PAM序列为NRY的编辑位点，可以不受PAM限制。3.根据权利要求1所述的黑曲霉碱基编辑体系，其特征在于：所述的黑曲霉碱基编辑体系通过插入sgRNA，实现对特定碱基的编辑；所述的sgRNA为能够识别特定protospacer序列的sgRNA。4.一种黑曲霉碱基编辑体系的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)合成AID基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；(2)以pFC332
‑
BEC质粒为模板，获得Ptef和link
‑
nCas片段；(3)将pFC332质粒线性化，与AID基因片段、Ptef和link
‑
nCas片段连接，得到黑曲霉碱基编辑体系Target
‑
AID
‑
NGG载体。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于还包括如下步骤：(4)合成NGN突变序列片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；(5)以Target
‑
AID
‑
NGG载体为模板，获得SpG
‑
2、SpG
‑
3和SpG
‑
4片段；(6)将pFC332质粒线性化，与NGN突变序列片段、SpG
‑
2、SpG
‑
3和SpG
‑
4连接，得到黑曲霉碱基编辑体系Target
‑
AID
‑
NGN载体；或(4)合成NRY突变序列片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；(5)以Target
‑
AID
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NGG载体为模板，获得SpRY
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1、SpRY
‑
2、SpRY
‑
3和SpRY
‑
4片段；(6)将pFC332质粒线性化，与NRY突变序列片段、SpRY
‑
1、SpRY
‑
2、SpRY
‑
3和SpRY
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4连接，得到黑曲霉碱基编辑体系Target

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，周伟传，潘力，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：