敲减NR4A3基因表达的CAR-T载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种敲减NR4A3基因表达的CAR－T载体及其制备方法和应用，其中NR4A3基因敲减元件，包括U6启动子和NR4A3shRNA；CAR－T载体包括载体框架、CAR、以及NR4A3基因敲减元件，CAR和NR4A3基因敲减元件均连接在所述载体框架上，其中CAR中含有anti－MSLN单链抗体。本发明专利技术设计的CAR－T载体一方面能够表达并识别MSLN抗原蛋白，引导T细胞特异性靶向杀伤肿瘤细胞；另一方面，可以抑制CAR－T细胞中NR4A3的表达，降低肿瘤免疫逃逸，增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。的杀伤作用。的杀伤作用。

【技术实现步骤摘要】
敲减NR4A3基因表达的CAR
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T载体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及肿瘤免疫治疗技术，具体涉及一种敲减NR4A3基因表达的CAR
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T载体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，免疫细胞疗法应运而生并发展迅猛，研究发现T淋巴细胞是肿瘤细胞的天敌，其在肿瘤免疫应答中起主要作用，对肿瘤细胞具有极强的杀伤作用。
[0003]嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T
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Cell Immunotherapy，CAR
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T免疫疗法)是近几年来迅速发展起来的一种肿瘤过继免疫治疗的新途径，它是基于免疫系统识别与活化理论，通过基因工程技术使T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，赋予T细胞对肿瘤细胞表面抗原的特异性，从而实现肿瘤精准靶向治疗。同时，由于CAR
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T细胞是采用抗体识别抗原模式，因此不受MHC的限制。
[0004]目前，CAR
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T免疫疗法在治疗血液肿瘤方面取得了成功，但是其在实体肿瘤治疗方面很少应用，研究者普遍认为由于实体肿瘤具有异质性，且肿瘤周围抑制性的微环境却可能使CAR
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T细胞变得毫无效用，因此CAR
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T在实体肿瘤治疗方面的研究方向在于产生能够抵抗肿瘤微环境中免疫效应分子对CAR
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T细胞的抑制和对其凋亡的诱导。与治疗血液瘤相比，CAR
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T细胞在实体肿瘤治疗中的效果相对不够理想的一个重要原因是，实体肿瘤存在着免疫抑制微环境，该环境的一大特征就是大量表达免疫抑制抗原，这些免疫抑制抗原通常会和T细胞表面的抑制性受体，如PD
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1、TIM
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3、CTLA
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4相结合，从而使得CAR
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T细胞进入一种反应低下甚至耗竭的状态。
[0005]目前，有研究表明NR4A3的表达与T细胞表面的抑制性受体的表达类似，其在肿瘤浸润T细胞中高表达，且对NR4A3的表达进行抑制能够增强了CAR
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T细胞对肿瘤杀伤能力以及延长了实验动物的生存期。综上，开发一种具备较高的适应实体肿瘤免疫抑制微环境、减弱肿瘤微环境对T细胞的负面影响，以达到增强抗肿瘤作用的CAR
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T载体，具有重要的现实意义。
[0006]再者，间皮素(MSLN)是一种存在于细胞表面的锚定糖蛋白，因其在正常组织中不表达或间皮组织中低表达，但在多种实体肿瘤中高表达，特别在卵巢癌、结肠癌、胃癌等实体肿瘤，因而成为备受关注的实体肿瘤特异性靶向抗原。在确定了MSLN靶点的肿瘤特异性高表达以及正常组织低表达等优势后，如何采用低成本的方法来抑制肿瘤细胞免疫逃逸的发生，以增强靶向MSLN靶点的CAR
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T细胞对实体肿瘤细胞的杀伤，进而提高CAR
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T治疗效果，成为CAR
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T治疗的一个技术难题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于设计一种敲减NR4A3基因表达并靶向MSLN的CAR
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T载体及其制备方法和应用，CAR
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T载体是以实体肿瘤细胞的特异性蛋白MSLN作为靶点，具有肿瘤特异性
高表达等特点，安全性高；且其通过NR4A3基因敲减元件，特异性敲减CAR
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T细胞中NR4A3的表达，以有效降低肿瘤免疫抑制微环境对CAR
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T细胞的抑制作用，进而增强CAR
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T细胞的抗肿瘤功能。
[0008]实现专利技术目的的技术方案如下：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种NR4A3基因敲减元件，包括U6启动子和NR4A3 shRNA，所述U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述NR4A3 shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
[0010]第二方面，本专利技术提供了一种CAR
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T载体，包括载体框架、CAR、以及第一方面中所述的NR4A3基因敲减元件，所述CAR和所述NR4A3基因敲减元件均连接在所述载体框架上。
[0011]进一步的，所述CAR包括启动子EF1a、引导肽、跨膜结构域、共刺激结构域、信号转导域。
[0012]优选的，所述引导肽为引导肽CD8，且所述引导肽CD8的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
[0013]所述跨膜结构域为CD8α，且所述CD8α的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
[0014]所述共刺激结构域包括共刺激结构域CD28、共刺激结构域4
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1BB，且所述共刺激结构域CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述共刺激结构域4
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1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
[0015]所述信号转导域为CD3ζ，且所述CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0016]进一步的，所述载体框架为慢病毒载体。
[0017]更进一步的，所述慢病毒载体为pLenti
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MCS
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EF1
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GFP Lentiviral Expression Vector。
[0018]进一步的，所述CAR还包括anti
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MSLN单链抗体，所述anti
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MSLN单链抗体用于编码Anti
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MSLN特异性蛋白，且所述anti
‑
MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0019]第三方面，本专利技术提供了一种CAR
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T载体的构建方法，包括以下步骤：
[0020]步骤1、制备CAR和NR4A3基因敲减元件；
[0021]步骤2、将CAR与NR4A3基因敲减元件整合，形成整合序列；
[0022]步骤3、将整合序列保存在pcDNA3.1(+)质粒上；
[0023]步骤4、对步骤3中pcDNA3.1(+)质粒双酶切，分离后获得含有整合序列的目的片段；
[0024]对慢病毒载体双酶切，获得载体框架；
[0025]步骤5、将目的片段与载体框架连接，对连接产物转化并提取获得含有CAR和NR4A3基因敲减元件的重组质粒，即获得CAR
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T载体。
[0026]进一步的，所述CAR包括anti
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MSLN单链抗体，所述anti
‑
MSLN单链抗体用于编码Anti
‑
MSLN特异性蛋白，且所述anti
‑
MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0027]第四方面，本专利技术提供了一种CAR
‑
T细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NR4A3基因敲减元件，其特征在于：包括U6启动子和NR4A3 shRNA，所述U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述NR4A3 shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。2.一种CAR－T载体，其特征在于：包括载体框架、CAR、以及权利要求1所述的NR4A3基因敲减元件，所述CAR和所述NR4A3基因敲减元件均连接在所述载体框架上。3.根据权利要求2所述的CAR－T载体，其特征在于：所述CAR包括启动子EF1a、引导肽、跨膜结构域、共刺激结构域、信号转导域。4.根据权利要求3所述的CAR－T载体，其特征在于：所述引导肽为引导肽CD8，且所述引导肽CD8的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述跨膜结构域为CD8α，且所述CD8α的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述共刺激结构域包括共刺激结构域CD28、共刺激结构域4－1BB，且所述共刺激结构域CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述共刺激结构域4－1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述信号转导域为CD3ζ，且所述CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。5.根据权利要求2所述的CAR－T载体，其特征在于：所述载体框架为慢病毒载体。6.根据权利要求5所述的CAR－T载体，其特征在于：所述慢病毒载体为pLenti－MCS－EF1－GFP Lentiviral Expression Vector。7.根据权利要求2～6任一项所述的CAR－T载体，其特征在于：所述CAR还包括anti－MSLN单链抗体，所述anti－MSLN单链抗体用于编码Anti－MSLN特异性蛋白，且所述anti－MSLN单链...

【专利技术属性】
技术研发人员：田晓丽，刘国迪，顾章杰，
申请(专利权)人：上海怡豪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：