一种通过HPLC-MS检测CYP4V2酶体外活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过HPLC

【技术实现步骤摘要】
一种通过HPLC
‑
MS检测CYP4V2酶体外活性的方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种通过HPLC
‑
MS检测CYP4V2酶体外活性的方法。

技术介绍

[0002]结晶样视网膜变性(BCD)是一种常染色体隐性遗传的进展性视网膜变性疾病，其主要的临床特征为闪亮的黄白色结晶沉积于视网膜后极部，并伴有进展性视网膜色素上皮(RPE)细胞、脉络膜毛细血管及光感受器细胞的萎缩。BCD主要的致病基因为CYP4V2。CYP4V2基因是细胞色素氧化酶P450家族的成员，参与多不饱和脂肪酸的ω
‑
羟化过程。
[0003]细胞色素P450主要分布在内质网和线粒体内膜上，是一类末端加氧酶，参与了多种内源物质和外源物质的合成与代谢过程，同时也是一种ω
‑
脂肪酸羟化酶，它的催化效率具有区域选择性和脂肪酸长链选择，在细胞内脂质代谢方面发挥重要作用，P450催化物质代谢的分子机制是分子氧的一个氧原子引入底物，底物被氧化成水溶性较强的代谢物。P450作用可用以下简式表示：
[0004]DH(底物)+NADPH+H
+
+O2→
D
‑
OH+NADP
+
+H2O
[0005]CYP4V2蛋白(又称为CYP4V2酶)主要分布于RPE细胞，参与一些关键性的内源性类花生酸的分解和合成，CYP4V2酶表达异常使得类花生酸脂质沉积导致RPE细胞受损患者视力退化(瞿玲辉.CYP4V2基因突变在结晶样视网膜变性中的作用机制[J].中华实验眼科杂志,2014,032(008):756
‑
759)。
[0006]AAV
‑
hCYP4V2病毒载体为携带人CYP4V2正常基因的AAV载体。AAV
‑
hCYP4V2病毒载体经视网膜下腔注射到由于人CYP4V2基因突变导致的结晶样视网膜变性患者后，可将正常的CYP4V2基因拷贝携带到患者视网膜细胞中，补充视网膜细胞中正常CYP4V2基因的表达量，表达出的CYP4V2蛋白可以弥补由于自身CYP4V2基因突变导致的缺失蛋白，从而恢复视网膜细胞功能，以达到治疗的目的。因此，AAV
‑
hCYP4V2病毒载体可以作为基因治疗药物。
[0007]根据CDE发布的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则(试行)》要求，基因治疗药物需建立与产品体内作用机制相同或相关的生物学活性分析方法用药产品的功能活性研究。功能活性方法通常是将基因治疗产品在体外感染、转染或转导易感细胞系，随后测定所关注的表达基因的一些功能，例如细胞生长刺激或抑制试验、酶活性测定。
[0008]现有技术中，体外测定CYP450酶活的方法是收集细胞或肝组织的微粒体(Nakano M,Kelly E J,Rettie A E.Expression and Characterization of CYP4V2 as a Fatty Acid
‑
Hydroxylase[J].Drug metabolism and disposition:the biological fate of chemicals,2009,37(11):2119
‑
2122)，测定方法为加入探针、NADPH辅酶、反应缓冲液、微粒体，孵育后测定产物的量，以此来确定目的蛋白CYP450的酶活。现有技术缺陷：传统方法存在实验耗时久、微粒体不易得到、微粒体不易定量，且不是直接测定酶活等干扰结果的问题。现有技术中的方法不适用于AAV
‑
CYP4V2病毒载体活性的测定。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是提供一种通过HPLC
‑
MS检测CYP4V2酶体外活性的方法。
[0010]现有技术中还没有适用于一种用于AAV
‑
hCYP4V2酶活功能活性检测的方法，基于该现状，本专利技术的专利技术人利用CYP4V2基因的作用机制开发了一种全新的AAV
‑
hCYP4V2酶活功能活性检测方法。
[0011]本专利技术提供了一种对药物制剂进行质控的方法；
[0012]所述药物制剂的适应症为CYP4V2缺陷引起的结晶样视网膜变性；
[0013]所述药物制剂的活性成分为CYP4V2基因重组腺相关病毒；
[0014]所述方法包括如下步骤：将药物制剂感染腺相关病毒易感细胞，然后加入花生四烯酸(AA)溶液，培养后收集上清；将所述上清制备为上样液，采用HPLC
‑
MS检测，获得所述上清中的20
‑
羟
‑
二十烷四烯酸(20
‑
HETE)含量。
[0015]CYP4V2基因重组腺相关病毒是将CYP4V2基因插入腺相关病毒的基因组得到的重组腺相关病毒；所述腺相关病毒作为CYP4V2基因的表达载体。
[0016]所述药物制剂的适应症为人CYP4V2缺陷引起的结晶样视网膜变性。
[0017]CYP4V2缺陷具体为CYP4V2基因缺陷。
[0018]人CYP4V2缺陷具体为人CYP4V2基因缺陷。
[0019]所述药物制剂的活性成分为人CYP4V2基因重组腺相关病毒。
[0020]人CYP4V2基因重组腺相关病毒是表达人CYP4V2基因的重组腺相关病毒。
[0021]所述人CYP4V2基因为编码人CYP4V2蛋白的基因。
[0022]所述人CYP4V2蛋白具体可为如下(a1)或(a2)或(a3)：
[0023](a1)SEQ ID NO：2所示的蛋白质；
[0024](a2)来源于人且与SEQ ID NO：2所示的蛋白质具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
[0025](a3)将SEQ ID NO：2所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0026]所述80％以上同一性具体可为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％以上同一性。
[0027]人CYP4V2基因可为如下(b1)或(b2)或(b3)：
[0028](b1)SEQ ID NO：1中第1131
‑
2708位核苷酸所示的DNA分子；
[0029](b2)来源于人且与(b1)具有80％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0030](b3)在严格条件下与(b1)杂交且编码所述的DNA分子。
[0031]所述80％以上同一性具体可为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％以上同一性。
[0032]所述腺相关病毒包括但不限于如下腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对药物制剂进行质控的方法；所述药物制剂的适应症为CYP4V2缺陷引起的结晶样视网膜变性；所述药物制剂的活性成分为CYP4V2基因重组腺相关病毒；所述方法包括如下步骤：将药物制剂感染腺相关病毒易感细胞，然后加入花生四烯酸溶液，培养后收集上清；将所述上清制备为上样液，采用HPLC
‑
MS检测，获得所述上清中的20
‑
HETE的含量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：CYP4V2基因重组腺相关病毒是将CYP4V2基因插入腺相关病毒的基因组得到的重组腺相关病毒；所述腺相关病毒作为CYP4V2基因的表达载体。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述CYP4V2缺陷为人CYP4V2缺陷；所述CYP4V2基因重组腺相关病毒为人CYP4V2基因重组腺相关病毒。4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述感染的MOI值为1
×
105‑9×
105。5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：将药物制剂感染腺相关病毒易感细胞的方法依次包括如下步骤：(1)将腺相关病毒易感细胞接种至细胞培养板，培养12
‑
20h，然后弃除上清；(2)加入含1
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张世贤，王会利，陈邵宏，杨丽萍，
申请(专利权)人：北京中因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：