一种重组生物体及生产多种类环孢素氨基酸的方法技术

一种重组生物体及生产多种类环孢素氨基酸的方法，该方法包括生物体构建步骤，包括提供敲除内源基因后的生物体，将木糖代谢基因整合至所述生物体的基因组中，获得可使用木糖生产S7P的生物体；DDGS

【技术实现步骤摘要】
一种重组生物体及生产多种类环孢素氨基酸的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种重组生物体及生产多种类环孢素氨基酸的方法。

技术介绍

[0002]太阳光中的紫外线会对人类的皮肤造成伤害。照射到地面的紫外线分为UVA(315～400nm)和UVB(280～315nm)两种。UVB的能量高，能直接损伤皮肤细胞，引起皮肤红肿、发炎、细胞凋亡和DNA损伤；UVA的穿透力更强，可以达到皮肤深处并缓慢生成氧化自由基，引起DNA损伤、皮肤衰老、暗沉。防晒对每个人都重要，然而现有的防晒手段存在很多问题。物理防晒剂采用氧化锌或二氧化钛金属氧化物颗粒反射紫外线，但是这些颗粒物的肤感较差，同时还易堵塞毛孔。化学防晒剂例如二苯酮、水杨酸乙基己酯等，它们可以渗透到皮肤中并保留吸收紫外线的能力，肤感更为轻盈。但现有的化学防晒物质光稳定性不高，且会缓慢释放氧化自由基损伤皮肤。这些防晒分子还会对海洋生物造成危害。
[0003]类环孢素氨基酸(Mycosporine
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like amino acids，简称MAAs或MAA，亦称类菌胞素氨基酸)是一类在海洋生物中广泛存在的分子家族，它们能吸收紫外线并以热能的方式释放出去。天然、温和无刺激的特性使得它们有望成为一类全新的防晒成分。MAAs在自然界中主要由藻类微生物或大型藻类生产，其较低的碳固定效率和低生长速率使得MAAs产量低下。近两年，学术界已经成功使用大肠杆菌、酿酒酵母等工程微生物生产MAAs，这些微生物生长迅速、基因改造方便，可以带来更大的产量。现有技术中使用酿酒酵母生产一种MAA分子——shinorine。酿酒酵母在生产多种MAA分子上具有相当的潜力，但前人仅尝试了shinorine这一个分子，且产量较低。

技术实现思路

[0004]根据第一方面，在一实施例中，提供一种构建重组生物体的方法，包括：
[0005]生物体构建步骤，包括提供敲除内源基因后的生物体，将木糖代谢基因整合至所述生物体的基因组中，获得可使用木糖生产S7P的生物体；
[0006]DDGS
‑
OMT的构建步骤，包括将DDGS基因、OMT基因中的至少一种整合至生物体构建步骤所得的生物体的基因组中，获得可使用木糖生产4DG的生物体。
[0007]根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项的方法获得的重组生物体。
[0008]根据第三方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项的方法获得的重组生物体生产的化合物。
[0009]根据第四方面，在一实施例中，提供一种重组生物体，所述生物体的至少部分内源基因被敲除，且所述生物体的基因组中整合有1)木糖代谢基因，以及2)DDGS基因、OMT基因中的至少一种。
[0010]依据上述实施例的一种重组生物体及生产多种类环孢素氨基酸的方法，本专利技术通过敲除内源性基因，显著提高类环孢素氨基酸的产量。
[0011]在一实施例中，显著提高类环孢素氨基酸的紫外吸收强度。
[0012]在一实施例中，还可通过重组生物体生产多种类环孢素氨基酸或其类似物。
附图说明
[0013]图1为酵母改造的示意图；
[0014]图2为Gadusol和3种MAA生产的代谢途径示意图；
[0015]图3为不同生物的MAA生产途径和生产基因；
[0016]图4.1为TAL1基因的敲除示意图；
[0017]图4.2为菌落PCR结果图；
[0018]图4.31、图4.32为TAL1基因敲除后的测序结果图；
[0019]图5.1为xylose代谢途径的敲入示意图；
[0020]图5.2为通过PCR扩增了左侧同源臂、右侧同源臂、xyl1、xyl2、xyl3基因的电泳结果图；
[0021]图5.3为xylose代谢途径的菌落PCR结果图；
[0022]图5.4为xyl1、xyl2、xyl3基因插入后的测序结果图；
[0023]图6.1为DDGS
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OMT的敲入过程示意图；
[0024]图6.2为DDGS
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OMT敲入后的PCR结果图；
[0025]图6.3为DDGS
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OMT敲入后的菌落PCR结果图；
[0026]图6.4为DDGS
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OMT敲入后的测序结果图；
[0027]图7为改造菌株在不同碳源下的生长曲线；
[0028]图8为氨基酸连接酶的组合表达示意图；
[0029]图9.1～9.4为Shinorine或Porphyra
‑
334的发酵和生产结果图；
[0030]图10.1～10.4为酵母发酵产物的高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)检测结果图；
[0031]图11.1为再次插入OMT
‑
DDGS基因以提高基因拷贝数，同时敲除Nqm1基因的示意图；
[0032]图11.2为再次插入OMT
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DDGS基因以提高基因拷贝数，同时敲除Nqm1基因的PCR扩增结果图；
[0033]图11.3为再次插入OMT
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DDGS基因以提高基因拷贝数，同时敲除Nqm1基因的菌落PCR结果图；
[0034]图11.4为再次插入OMT
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DDGS基因以提高基因拷贝数，同时敲除Nqm1基因的测序结果；
[0035]图12.1为优化后的shinorine和porphyra
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334的生产过程示意图；
[0036]图12.2为优化后的shinorine和porphyra
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334的334nm的紫外波段吸收峰；
[0037]图12.3为优化后的shinorine和porphyra
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334的OD334数值；
[0038]图13.1为palythine的生产过程示意图；
[0039]图13.2为palythine的320nm的紫外波段吸收峰；
[0040]图13.3为palythine的OD320数值；
[0041]图14.1为gadusol生产菌株的改造过程示意图；
[0042]图14.2为gadusol生产菌株的PCR扩增结果图；
[0043]图14.3为gadusol生产菌株的菌落PCR结果图；
[0044]图14.4为gadusol生产菌株的测序结果图；
[0045]图15.1为gadusol的290nm的紫外波段吸收峰；
[0046]图15.2为L4的吸光值减去对应的对照组吸光值后的结果图；
[0047]图16.1为gadusol、palythine、shinorine和porphyra
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334这四种分子从275nm至360nm的吸收峰；
[0048]图16.2为gadusol、palythine、shinorine和porphyra本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建重组生物体的方法，包括：生物体构建步骤，包括提供敲除内源基因后的生物体，将木糖代谢基因整合至所述生物体的基因组中，获得可使用木糖生产S7P的生物体；DDGS
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OMT的构建步骤，包括将DDGS基因、OMT基因中的至少一种整合至生物体构建步骤所得的生物体的基因组中，获得可使用木糖生产4DG的生物体。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，生物体构建步骤中，敲除的内源基因包括TAL1基因、Nqm1基因中的至少一种。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，生物体构建步骤中，所述木糖代谢基因包括xyl1基因、xyl2基因、xyl3基因中的至少一种；优选地，生物体构建步骤中，使用pTDH3启动子启动xyl1基因的表达；优选地，生物体构建步骤中，使用pPGK1启动子启动xyl2基因的表达；优选地，生物体构建步骤中，使用pTEF2启动子启动xyl3基因的表达；优选地，生物体构建步骤中，xyl1基因、xyl2基因、xyl3基因中的至少一种的插入位点为his3位点。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，DDGS
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OMT的构建步骤中，使用pTDH3启动子启动OMT基因的表达；优选地，DDGS
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OMT的构建步骤中，使用pPGK1启动子启动DDGS基因的表达；优选地，DDGS
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OMT的构建步骤中，所述生物体的基因组中OMT基因的拷贝数≥1；优选地，DDGS
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OMT的构建步骤中，所述生物体的基因组中DDGS基因的拷贝数≥1；优选地，DDGS
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OMT的构建步骤中，所述生物体的基因组中OMT基因的拷贝数≥2；优选地，DDGS
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OMT的构建步骤中，所述生物体的基因组中DDGS基因的拷贝数≥2；优选地，DDGS
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OMT的构建步骤中，所述DDGS基因和/或OMT基因的插入位点为308位点。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括连接酶基因构建步骤，包括将可表达氨基酸连接酶的基因整合至DDGS
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OMT的构建步骤中得到的生物体的基因组中，获得可生产类环孢素氨基酸的生物体。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，连接酶基因构建步骤中，所述氨基酸连接酶包括AGL酶、ALAL酶中的至少一种；所述AGL酶包含Np5598蛋白、NlmysC蛋白、Am4257蛋白中的至少一种，所述ALAL酶包含Am4256蛋白、Np5597蛋白、NlmysD蛋白中的至少一种；所述Np5598蛋白包含与SEQ ID NO:16所示氨基酸序列至少具有90％相似性的序列；所述NlmysC蛋白包含与SEQ ID NO:23所示氨基酸序列至少具有90％相似性的序列；所述Am4257蛋白包含与SEQ ID NO:24所示氨基酸序列至少具有90％相似性的序列；所述Am4256蛋白包含与SEQ ID NO:18所示氨基酸序列具有至少90％相似性的序列；所述Np5597蛋白包含与SEQ ID NO:25所示氨基酸序列具有至少90％相似性的序列；所述NlmysD蛋白包含与SEQ ID NO:17所示氨基酸序列具有至少90％相似性的序列。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，连接酶基因构建步骤中，所述氨基酸连接酶包含Np5598蛋白以及NlmysD蛋白；或，连接酶基因构建步骤中，所述氨基酸连接酶包含Np5598蛋白以及NlmysD蛋白；或，连接酶基因构建步骤中，所述氨基酸连接酶包含Np5598蛋白以及Am4256蛋白；
或，连接酶基因构建步骤中，所述氨基酸连接酶包含Np5598蛋白以及NlmysC蛋白；或，连接酶基因构建步骤中，所述氨基酸连接酶包含Np5598蛋白以及Np5597蛋白。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，连接酶基因构建步骤中，AGL基因的启动子包括pTDH3启动子；优选地，连接酶基因构建步骤中，ALAL基因的启动子包括pPGK1启动子；优选地，连接酶基因构建步骤中，AGL基因和/或ALAL基因的插入位点为106位点；优选地，连接酶基因构建步骤中，还包括从所述可生产类环孢素氨基酸的生物体中回收产物；优选地，所述产物包含类环孢素氨基酸。9.如权利要求5～8任意一项所述的方法，其特征在于，还包括mysH构建步骤，包括将mysH基因整合至所述连接酶基因构建步骤中得到的生物体的基因组中，获得可生产类环孢素氨基酸的生物体。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，使用pTEF2启动子启动mysH基因的表达；优选地，mysH构建步骤中，还包括从所述可生产类环孢素氨基酸的生物体中回收产物；优选地，m...

【专利技术属性】
技术研发人员：王博祥，余俊，
申请(专利权)人：深圳市灵蛛科技有限公司，
类型：发明
国别省市：