一种金黄色葡萄球菌检测用阳性质控的制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，提供了一种金黄色葡萄球菌检测用阳性质控的制备方法，包括以下步骤：PCR引物设计：在LAMP检测体系中的外引物F3和B3的外侧分别设计PCR的两条引物P1和P2；PCR扩增：使用水浴法提取增菌培养后的菌体的基因组DNA，作为PCR扩增的模板，在用于检测待测菌的LAMP反应体系中进行扩增反应；所述的外引物F3和B3是介导等温扩增的外引物。本发明专利技术还公开了相应的金黄色葡萄球菌检测用阳性质控和应用。采用本发明专利技术的方法制备的阳性质控具有稳定性好、容易保存和复制的优点。容易保存和复制的优点。容易保存和复制的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种金黄色葡萄球菌检测用阳性质控的制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种金黄色葡萄球菌检测用阳性质控，其制备方法及应用。

技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一类可引起人类全身感染的常见病原菌，其产生的肠毒素也可污染食物而致食物中毒，因此对于该菌的预防和检测非常重要。
[0003]环介导等温扩增反应（Loop
‑
mediated isothermal amplification，缩写为LAMP）是一种在等温条件下进行核酸扩增检测的技术，可被广泛应用于包括金黄色葡萄球菌在内的微生物检测。在LAMP检测中所用的阳性质控一般为从目标生物中提取全基因组DNA，由于基因组片段大，容易降解，因此稳定性较差，不易保存，不利于检测。同时，由于LAMP扩增原理较为复杂，涉及到多条引物（至少包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP四条引物），且引物间很容易发生非特异性结合，因此常规制备阳性质控的方法在金黄色葡萄球菌LAMP检测中不适用，迄今也尚未见到有关金黄色葡萄球菌LAMP检测用阳性质控的制备方法的报道。
[0004]因此，亟需发展一种针对金黄色葡萄球菌LAMP检测用阳性质控的制备方法以及相应的金黄色葡萄球菌LAMP检测用阳性质控。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题在于克服目前金黄色葡萄球菌LAMP检测中没有有效的阳性质控，而且所用的全基因组阳性质控存在不稳定、不易保存的问题。
[0006]本专利技术提供了一种金黄色葡萄球菌检测用阳性质控的制备方法，能够广泛应用于基于LAMP原理的金黄色葡萄球菌检测中阳性质控的制备。本专利技术对的方法以设计PCR引物、进行PCR扩增为基础。
[0007]PCR引物设计：设计一对PCR的两条引物P1和P2；和/或PCR扩增：提取金黄色葡萄球菌菌体的基因组DNA，作为PCR扩增的模板，在用于检测待测菌的LAMP反应体系中进行扩增反应；所述的引物P1和P2的序列如下：P1：5
’‑
GATCCTCTAGAGATTGC
‑3’ꢀ
，SEQ ID NO：1；P2：5
’‑
TGTCCATGACGCCCAAGT
‑3’
，SEQ ID NO：2。
[0008]LAMP，英文名称为“Loop
‑
mediated isothermal amplification”，中文译为环介导等温扩增反应。针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60
‑
65℃恒温扩增，15
‑
60分钟左右即可实现109～10
10
倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。为了便于比较，本专利技术制备了金黄色葡萄球菌检测用
阳性质控，以期在观察扩增产物白色浑浊沉淀的同时，有阳性质控作为比较，能够获得更加精确的检测结果。
[0009]本专利技术的方法中，所述的PCR引物为在LAMP扩增区域的上下游分别设计PCR上下游引物。LAMP体系通常需要设计外引物对（F3和B3）和内引物对（FIP和BIP）（图1）。本专利技术的两条引物P1和P2分别设计在LAMP体系为基础的外引物F3和B3的外侧。具体而言，一条引物位于LAMP外引物对中的上游外引物的上游，另一条引物位于LAMP外引物对中的下游外引物的下游。
[0010]本专利技术的方法中，提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA可以采用本领域的常规方法，较好的可以采用水浴法，优选沸水浴。
[0011]整体而言，本专利技术提供的金黄色葡萄球菌检测用阳性质控的制备方法，包括如下步骤：（1）PCR引物设计；（2）PCR扩增和产物纯化回收；（3）载体连接、转化和重组子筛选；（4）测序验证；（5）等温扩增验证，判断获得的质粒是否可以作为检测用的阳性质控。
[0012]本专利技术的方法中，所述的PCR扩增为采用所设计的PCR引物在一定的反应体系下进行PCR扩增反应，然后进行产物纯化回收。
[0013]本专利技术的方法中，所述的产物纯化回收为割胶回收，也可以直接将PCR产物通过离心吸附柱进行纯化回收，优选地为割胶回收。
[0014]本专利技术的方法中，所述的载体连接为将目的片段连接到质粒载体上；当载体为T载体时，可以直接将PCR产物和T载体通过DNA连接酶连接；当载体非T载体时，可以利用限制性内切酶，分别切割载体和PCR产物，然后通过连接酶将二者进行连接。优选地为T载体连接，T载体可以为pMD19
‑
T载体、pGEM
‑
T载体等。所述的转化为将上述质粒导入到感受态细胞中，可以为CaCl2转化法，也可以为电转化法等。所述的重组子筛选为通过菌落PCR法筛选符合预期目的片段大小的单菌落。所述的感受态细胞优选地为DH5α。
[0015]本专利技术的方法中，所述的测序验证为将片段大小符合预期的菌落PCR产物纯化回收，通过测序与PCR扩增靶基因片段序列进行比对确认。测序可以选用焦磷酸测序等方法。
[0016]本专利技术的方法中，所述的等温扩增验证为以上述经测序验证序列正确的质粒DNA为模板，通过LAMP扩增反应验证扩增能否进行正常的等温扩增来进行确认。若等温扩增反应能够正常扩增，则获得的质粒可以作为阳性质控；若等温扩增反应不能正常扩增，则获得的质粒不可以作为阳性质控。
[0017]本专利技术涉及在样品中微生物的快速检测方法，可以参考申请号为CN202210761197.5的LAMP检测体系，也可以按照如下方法：（1）取样：获取样品；（2）在增菌液中增菌：将所取样品在LP增菌液中过夜培养；（3）提取基因组DNA：使用水浴法提取在增菌液中增菌培养后的菌体的基因组DNA；（4）以基因组DNA为模板，在针对待测菌的LAMP反应体系中进行扩增反应；（5）通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在待测菌。
[0018]本专利技术的方法中，所述的取样为，每批样品可以随机抽两个或两个以上包装完好的单位，试样量不少于5g，更好的，不少于10g。
[0019]本专利技术的方法中，所述的增菌为取上述试样10g放入装有增菌液的容器中，36
o
C
±
1 oC
培养18
‑
24小时。例如可以是36
o
C培养18小时，或者36
o
C培养24小时。
[0020]本专利技术的方法中，所述增菌液可以是LP增菌液或者SCDLP液体培养基。LP增菌液或者SCDLP液体培养基都可以用于培养细菌并使之增殖，但是LP培养液成分更为简单、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种金黄色葡萄球菌检测用阳性质控的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：PCR引物设计：设计一对PCR的两条引物P1和P2；PCR扩增：使用水浴法提取含有金黄色葡萄球菌基因组的DNA，作为模板进行PCR扩增；所述的引物P1和P2的序列如下：P1：5
’‑
GATCCTCTAGAGATTGC
‑3’ꢀ
，SEQ ID NO：1；P2：5
’‑
TGTCCATGACGCCCAAGT
‑3’
，SEQ ID NO：2。2.根据权利要求1所述的一种金黄色葡萄球菌检测用阳性质控的制备方法，其特征在于，所述的制备方法在获得金黄色葡萄球菌检测用阳性质控的扩增产物后，包括以下步骤中的一个或者几个：载体连接、转化和重组子筛选；测序验证；等温扩增验证，判断获得的质粒是否可以作为阳性质控。3.根据权利要求2所述的一种金黄色葡萄球菌检测用阳性质控的制备方法，其特征在于，通过割胶回收或者吸附柱纯化回收扩增产物。4.根据权利要求2所述的一种金黄色葡萄球菌检测用阳性质控的制备方法，其特征在于，所述的载体连接为将目的片段连接到质粒载体上，通过连接酶将二者进行连接；所述的转化为将质粒导入到感受态细胞中；所述的重组子筛选为后通过菌落PCR筛选符合预期目的片段大小的重组子；所述的测序验证为将片段大小符合预期的菌落PCR产物纯化回收，...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，李雪玲，彭家伟，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：