用于基因缺失/插入/融合突变RPA检测的试剂组合物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了用于基因缺失/插入/融合突变的RPA检测试剂组合物和检测方法，对于缺失突变基因和插入突变基因的检测，仅需设计一对通用型上下游RPA引物，并分别设计特异性识别突变型和野生型模板的exo探针或fpg探针，实现缺失突变和插入突变基因的精准检测；对于基因融合突变检测，在发生融合突变的两个基因片段上分别设计一条特异性上下游RPA引物，exo探针或fpg探针可以设计在发生融合的两个基因的任一基因片段上，也可以设计在两个基因的融合位置处，实现了基因融合突变的精准检测。本发明专利技术首次将RPA引物联合exo探针或fpg探针用于基因缺失/插入/融合突变的检测，且检测速度快、特异性好、灵敏度高。灵敏度高。灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
用于基因缺失/插入/融合突变RPA检测的试剂组合物、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及基因突变检测
，具体涉及一种用于基因缺失/插入/融合突变RPA检测的试剂组合物、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]重组酶聚合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA反应体系的关键成分是：DNA修复酶、重组酶、重组酶载入因子、单链DNA结合蛋白(SSB)、具有链置换活性的DNA聚合酶。此外，待检测的模板是RNA时，还需要在RPA反应体系中加入RNA逆转录酶。RPA的原理是重组酶与引物或探针结合形成的蛋白
‑
DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列，一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，形成稳定的单链。在扩增的过程中，DNA修复酶切割标记在探针上的荧光报告基团，从而释放出荧光信号，然后通过荧光定量PCR仪实时监测荧光信号的种类和强度，实现对野生型和突变型基因、以及不同种类的突变型基因的定性和定量检测；还可以在核酸扩增反应结束后，直接检测反应体系的终末荧光信号的种类和强度，实现对野生型和突变型基因、以及不同种类的突变型基因的定性和半定量检测。
[0003]RPA所涉及关键成分的混合物在常温下也有活性，反应的最适温度在25℃
‑
42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。不管是DNA还是RNA检测，整个过程进行得非常快，一般可在20分钟左右完成检测过程。此外，由于RPA不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计，RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到25
‑
40个碱基。但也有将PCR引物成功应用于RPA的研究报道。总之，对于RPA，引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA探针包括exo探针、nfo探针和fpg探针，其中nfo探针多用于测流试纸条检测中，exo探针和fpg探针用于实时荧光检测中。
[0004]RPA探针法识别基因单碱基突变的能力差，这导致目前关于RPA的研究报道大多是关于病原菌的检测，在基因突变检测方面的应用极少。有研究报道把需要检测的模板经过高温变性与特异识别野生型序列的肽核酸(PNA)探针结合，当进行RPA扩增时，PNA探针屏蔽了野生型模板的扩增，从而实现基因单碱基突变的检测。对于基因的其它突变类型如缺失突变、插入突变和融合突变，这些突变类型同样在基因的早期诊断、治疗和预后等方面具有重要的临床意义，且这些突变类型一般是多个碱基的缺失、插入或者基因片段的融合。目前没有RPA exo探针法或fpg探针法检测缺失突变、插入突变和融合突变的研究报道。

技术实现思路

[0005]鉴于此，本专利技术的目的之一是针对上述问题，提供一种用于基因缺失/插入/融合突变RPA检测的试剂组合物，所述试剂组合物包括以下反应成分：
⑴
上游引物和下游引物，
用于扩增待检靶基因；
⑵
一组含有一个脱碱基核苷酸类似物残基的荧光标记探针，用于识别待检基因的野生型和突变型序列；
⑶
待检核酸模板；
⑷
DNA修复酶(DNA repair enzymes)，其作用是当荧光标记的探针与靶分子互补配对形成双链DNA时，在DNA修复酶的切割作用下，探针上标记的荧光报告基团释放出荧光信号；
⑸
RPA恒温扩增的其它必需成分，包括重组酶、重组酶载入因子、具有链置换活性的DNA聚合酶或者具有链置换活性的DNA聚合酶+RNA逆转录酶、单链DNA结合蛋白、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)、其他辅助因子和能量分子、离子和缓冲体系；所述的RPA试剂组合物中的荧光标记探针，可以是exo探针，也可以是fpg探针。此外，当待检测的模板是RNA时，还需要在上述RPA检测试剂组合物中加入RNA逆转录酶，即可实现对RNA模板的检测。
[0006]所述RPA引物的设计原则是：
⑴
引物长度在25
‑
40nt之间；
⑵
碱基排布随机性高，
⑶
GC含量在30％
‑
70％之间；
⑷
Tm值在50
‑
100℃之间；
⑸
扩增片段避免形成二级结构而影响扩增；
⑹
扩增片段长度100
‑
300bp，最长不能超过500bp。
[0007]所述exo探针设计原则是：
⑴
探针总长度为40
‑
60nt；
⑵
距离探针5'
‑
末端25
‑
45nt位置用一个脱碱基核苷酸类似物残基替代原有的A、T、C或G碱基；
⑶
脱碱基核苷酸类似物残基的5'
‑
端和3'
‑
端的碱基分别标记一个荧光报告基团和淬灭基团，并且，荧光报告基团和淬灭基团的间距为1
‑
8nt。或者，脱碱基核苷酸类似物残基的5'
‑
端和3'
‑
端的碱基分别标记一个淬灭基团和荧光报告基团，并且，淬灭基团和荧光报告基团的间距为1
‑
8nt；
⑷
基因缺失/插入突变的识别位点位于脱碱基核苷酸类似物残基的5'
‑
端，或者，脱碱基核苷酸类似物残基的3'
‑
端，或者，位于脱碱基核苷酸类似物残基所在位置；
⑸
两个基因融合突变的融合位置识别位点位于脱碱基核苷酸类似物残基的5'
‑
端，或者，脱碱基核苷酸类似物残基的3'
‑
端，或者，位于脱碱基核苷酸类似物残基所在位置，或者，exo探针与待检核酸模板的互补配对位置在发生融合的两个基因的任一基因上；
⑹
3'
‑
末端标记一个阻断基团，阻止探针在扩增过程中作为引物延伸。
[0008]所述fpg探针的设计原则是：
⑴
探针总长度为30
‑
50nt；
⑵
距离探针5'
‑
末端5
‑
8nt位置用一个脱碱基核苷酸类似物残基替代原有的A、T、C或G碱基；
⑶
探针的5'
‑
末端标记一个淬灭基团，脱碱基核苷酸类似物残基标记一个荧光基团；或者，探针的5'
‑
末端标记一个荧光基团，脱碱基核苷酸类似物残基标记一个淬灭基团；
⑷
基因缺失/插入突变的识别位点位于脱碱基核苷酸类似物残基的5'
‑
端，或者，脱碱基核苷酸类似物残基的3'
‑
端，或者，位于脱碱基核苷酸类似物残基所在位置；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于基因缺失/插入/融合突变检测的RPA试剂组合物，其特征在于，包括以下反应成分：
⑴
上游引物和下游引物：扩增待检靶基因；
⑵
一组含有一个脱碱基核苷酸类似物残基的荧光标记探针：识别待检基因的野生型和突变型序列；
⑶
待检核酸模板；
⑷
DNA修复酶：荧光标记的探针与靶分子互补配对形成双链DNA，然后在DNA修复酶的切割作用下，探针上标记的荧光报告基团释放荧光信号；
⑸
RPA恒温扩增的其它必需成分，包括重组酶、重组酶载入因子、具有链置换活性的DNA聚合酶或者具有链置换活性的DNA聚合酶+RNA逆转录酶、单链DNA结合蛋白、三磷酸脱氧核苷酸、其他辅助因子和能量分子、离子和缓冲体系。2.如权利要求1所述的RPA试剂组合物，其特征在于：所述荧光标记探针是exo探针，并具有如下特征：
⑴
探针总长度为40
‑
60nt；
⑵
距离探针5'
‑
末端25
‑
45nt位置用一个脱碱基核苷酸类似物残基替代原有的A、T、C或G碱基；
⑶
脱碱基核苷酸类似物残基的5'
‑
端和3'
‑
端的碱基分别标记一个荧光报告基团和淬灭基团，并且，荧光报告基团和淬灭基团的间距为1
‑
8nt；或者，脱碱基核苷酸类似物残基的5'
‑
端和3'
‑
端的碱基分别标记一个淬灭基团和荧光报告基团，并且，淬灭基团和荧光报告基团的间距为1
‑
8nt；
⑷
基因缺失/插入突变的识别位点位于脱碱基核苷酸类似物残基的5'
‑
端，或者，脱碱基核苷酸类似物残基的3'
‑
端，或者，位于脱碱基核苷酸类似物残基所在位置；
⑸
两个基因融合突变的融合位置识别位点位于脱碱基核苷酸类似物残基的5'
‑
端，或者，脱碱基核苷酸类似物残基的3'
‑
端，或者，位于脱碱基核苷酸类似物残基所在位置，或者，exo探针与待检核酸模板的互补配对位置在发生融合的两个基因的任一基因上；
⑹
3'
‑
末端标记一个阻断基团，阻止探针在扩增过程中作为引物延伸。3.如权利要求1所述的RPA试剂组合物，其特征在于：所述荧光标记探针是fpg探针，并具有如下特征：
⑴
探针总长度为30
‑
50nt；
⑵
距离探针5'
‑
末端5
‑
8nt位置用一个脱碱基核苷酸类似物残基替代原有的A、T、C或G碱基；
⑶
探针的5'
‑
末端标记一个淬灭基团，脱碱基核苷酸类似物残基标记一个荧光报告基团；或者，探针的5'
‑
末端标记一个荧光报告基团，脱碱基核苷酸类似物残基标记一个淬灭基团；
⑷
基因缺失/插入突变的识别位点位于脱碱基核苷酸类似物残基的5'
‑
端，或者，脱碱基核苷酸类似物残基的3'
‑
端，或者，位于脱碱基核苷酸类似物残基所在位置；
⑸
两个基因融合突变的融合位置识别位点位于脱碱基核苷酸类似物残基的5'
‑
端，或
者，脱碱基核苷酸类似物残基的3'
‑
端，或者，位于脱碱基核苷酸类似物残基所在位置，或者，fpg探针与待检核酸模板的互补配对位置在发生融合的两个基因的任一基因上；
⑹
3'
‑
末端标记一个阻断基团，阻止探针在扩增过程中作为引物延伸。4.如权利要求1所述的RPA试剂组合物，其特征在于：在反应过程中，荧光标记的探针与靶分子互补配对形成双链DNA，然后在DNA修复酶的切割作用下，探针上标记的荧光报告基团释放荧光信号。5.如权利要求1
‑
4任一项所述的RPA试剂组合物，其特征在于：所述DNA修复酶选自核酸外切酶III、核酸外切酶IV、fpg酶；所述脱碱基核苷酸类似物残基是四氢呋喃残基，或者，其他脱嘌呤残基，或者，其他脱嘧啶残基；所述探针掺入一个或多个错配碱基，所述错配碱基包括G
‑
A、C
‑
T、T
‑
T、C
‑
C、A
‑
A、G
‑
G、C
‑
A和G
‑
T错配。6.如权利要求1
‑
3任一项所述的RPA试剂组合物，其特征在于：所述荧光报告基团选自6
‑
FAM、5
‑
FAM、HEX、JOE、VIC、FITC、Cy3、Cy5、TAMRA和ROX，以及其它荧光分子或发光基团；所述淬灭基团为荧光类淬灭剂或非荧光类淬灭剂，所述荧光类淬灭剂包括TAMRA、ROX染料，所述非荧光类淬灭剂包括DABCYL，BHQ1、BHQ2或BHQ3；所述阻断基团是在探针的3'
‑
末端标记磷酸基团、氨基基团、聚六乙二醇或者C3(三个碳原子的碳链)，或者，3'
‑
末端碱基使用反转碱基或双脱氧核苷酸。7.如权利要求1
‑
3任一项所述的RPA试剂组合物，其特征在于：所述探针掺入一个或多个衍生核苷酸，所述核苷酸衍生物包括锁核酸、肽核酸、脱氧肌苷、肌苷、7
‑
去氮
‑
2'
‑
脱氧肌苷、2
‑
氮杂
‑
2'
‑
脱氧肌苷、2'
‑
甲氧基肌苷、2'
‑
F肌苷、脱氧3
‑
硝基吡咯、3
‑
硝基吡咯、2'
‑
甲氧基3
‑
硝基吡咯、2'
‑
F3
‑
硝基吡咯、1
‑
(2'
‑
脱氧
‑
β
‑
D
‑
呋喃核糖)
‑3‑
硝基吡咯、脱氧5
‑
硝基吡咯、5
‑
硝基吲哚、2'
‑
甲氧基5
‑
硝基吲哚、2'
‑
F5
‑
硝基吲哚、脱氧4
‑
硝基苯并咪唑、4
‑
硝基苯并咪唑、脱氧4
‑
氨基苯并咪唑、4
‑
氨基苯并咪唑、脱氧水粉蕈素、2'
‑
F水粉蕈素、2'
‑
F4
‑
硝基苯并咪唑、肽核酸
‑5...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄庆，任晓东，李文满，苏宁，吕静，孙献歌，李若煦，鲁卫平，邓少丽，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军特色医学中心，
类型：发明
国别省市：