产亮氨酸氨肽酶的基因、枯草芽孢杆菌、构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及产亮氨酸氨肽酶的基因、枯草芽孢杆菌、构建方法和应用，本发明专利技术通过分析鉴定，筛选栖土曲霉的亮氨酸氨肽酶的基因，以pP43NMK为出发质粒成功构建pP43NMK

【技术实现步骤摘要】
产亮氨酸氨肽酶的基因、枯草芽孢杆菌、构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及产亮氨酸氨肽酶的基因、枯草芽孢杆菌、构建方法和应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]亮氨酸氨肽酶(Leucine aminopeptidase，lap)是氨肽酶中的一种，属于金属氨肽酶，它也具有水解多肽链氨基末端氨基酸的功能，能够从蛋白质和多肽中切割N端残基，不过它不单单水解多肽链N末端的亮氨酸，还可以同N末端的其他氨基酸发生作用，但它特异性识别和水解效率最高的氨基酸是亮氨酸，在水解Leu底物时，lap通常具有更加广泛的特异性。
[0003]用于食品蛋白水解物的制备是氨肽酶的主要工业应用之一。源自牛奶、大豆、肉类和谷物的蛋白质水解物基本上都是通过内肽酶和外肽酶的联合作用制备的，被广泛用于生产具有营养和药理重要性的生物活性肽，这些水解物是预消化成分的丰富来源，在肠道吸收过程中很容易被利用。
[0004]蛋白质的水解产生多肽和游离氨基酸，但是往往会伴随着苦味的产生，这是由于多肽链末端的疏水性氨基酸在水解中暴露出来所导致的，苦味是食品工业的主要限制因素，限制了食品蛋白水解物的消费和利用。亮氨酸氨肽酶作为一种多肽N端外切酶，能将肽链N端的氨基酸解离出来，从而减少多肽末端疏水性氨基酸含量，增强水解程度，从而降低苦味，所以亮氨酸氨肽酶在食品工业上有巨大的应用前景。
[0005]国内对于亮氨酸氨肽酶的研究主要集中在大学实验室，部分来源的亮氨酸氨肽酶基因已经被表征。潘进权2010年从雅致放射毛霉的发酵麸曲中纯化出了亮氨酸氨肽酶，显示了其对大豆蛋白水解具有协同作用；华南理工大学黄伟谦2014年从酱油曲霉中克隆出了亮氨酸氨肽酶sLAP1，并在毕赤酵母中成功表达，发酵酶活水平达到766.9U/mL，与碱性蛋白酶复配后对大豆蛋白水解度提高了23％，在蛋白水解以及脱苦应用中有很好的前景；席宏星2015年将来源枯草芽孢杆菌Zj016的亮氨酸氨肽酶基因克隆转化到毕赤酵母GS115的染色体上，成功实现了胞外分泌表达；张秋红2016年从雅致放射毛霉中克隆了亮氨酸氨肽酶基因，检测到其在细胞内进行了转录但蛋白质没有成功表达；李慧2016年克隆了蜡样芽孢杆菌CZ的亮氨酸氨肽酶基因，探究了不同表达载体在大肠杆菌宿主表达系统中的效果，酶活达到了22.40U/mL；林晓彤2020年将来自曲霉和嗜热真菌的8个亮氨酸氨肽酶基因在宿主黑曲霉HL
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1中进行表达，筛选出了高活性的亮氨酸氨肽酶基因lapA和The，并通过利用CRISPR/Cas9工具增加其基因拷贝数提高了表达量，最高酶活可达11701.2U/mL。
[0006]来源不同的亮氨酸氨肽酶基因已经被各种表达系统表达，而对栖土曲霉来源的蛋白酶的表征未见报道。曲霉属以其向环境中分泌高水平酶的能力而闻名，几十年来，该属分泌的几种酶已广泛用于食品和饮料行业，但是国内外对霉菌的研究主要集中在对米曲霉、黑曲霉、大豆曲霉和毛霉等，而对能产高水解能力蛋白酶的栖土曲霉的研究较少。
[0007]枯草芽孢杆菌是一种杆状的革兰氏阳性细菌，作为一种模式生物，已被广泛用于
工业用途的各种酶和生物活性化合物的生产。B.subtilis已被用作基因表达的有效系统，它的基因组序列已经发表，并对该细菌的基因调控和蛋白质功能的各个方面进行了分析(芽孢杆菌遗传储备中心，http://www.bgsc.org/)。由于相对便宜的大规模生产系统的可用性以及细菌向生长培养基中分泌高达20至25g/L的目标蛋白的能力，目前约60％的市售酶是在芽孢杆菌属物种中生产的。枯草芽孢杆菌被开发为有吸引力的宿主是因为以下几个原因：(i)它是非致病性的，并被认为是GRAS生物(通常被认为是安全的)；(ii)它在密码子使用上没有明显的偏好；(iii)它能够直接将功能性胞外蛋白直接分泌到培养基中。然而，两个障碍阻止了枯草芽孢杆菌的应用：(1)过多的细胞外蛋白酶会降解产生的外源蛋白质；(2)分离和结构的不稳定性导致基因表达降低。为了制作有效的表达宿主，破坏了几种细胞外蛋白酶基因以建立用于外源蛋白质生产的菌株，如枯草芽孢杆菌WB800，利用蛋白酶缺陷型的菌株表达外源蛋白，可以很好的解决蛋白酶水解修饰的问题。
[0008]如能获得栖土曲霉的亮氨酸氨肽酶基因，并将来自栖土曲霉的亮氨酸氨肽酶基因在枯草芽孢杆菌中进行表达，通过构建基因工程菌株以实现其大量高效表达，将为栖土曲霉在食品工业蛋白质水解物脱苦的进一步应用提供基础。

技术实现思路

[0009]本专利技术针对现有技术的上述问题，提供产亮氨酸氨肽酶的基因、枯草芽孢杆菌、构建方法和应用。
[0010]本专利技术的目的之一在于提供产亮氨酸氨肽酶的基因，其为从栖土曲霉上提取，其碱基序列为SEQ ID NO.1所示。
[0011]本专利技术的目的之二在于提供产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌，该菌株提提交生物保藏。
[0012]【生物保藏材料说明】
[0013]保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
[0014]保藏地址：中国武汉；
[0015]保藏日期：2022年5月3日；
[0016]保藏编号：CCTCC NO：M 2022535；
[0017]分类命名：枯草芽孢杆菌WB800/pP43NMK
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lap Bacillus subtilis WB800/pP43NMK
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lap。
[0018]本专利技术的目的之三在于提供产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌的构建方法，将上述产亮氨酸氨肽酶的基因转入大肠杆菌质粒E.coli JM109/pP43NMK中，得到重组质粒pP43NMK
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lap，将重组质粒pP43NMK
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lap转入枯草芽孢杆菌B.subtills WB800中，得到重组枯草芽孢杆菌WB800/pP43NMK
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lap。
[0019]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以作出如下的改进：
[0020]进一步，包括以下步骤：
[0021](1)产亮氨酸氨肽酶的基因的提取和克隆；
[0022](2)重组质粒pP43NMK
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lap的构建；
[0023](3)B.subtills WB800感受态制备；
[0024](4)重组枯草芽孢杆菌WB800/pP43NMK
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lap的制备。
[0025]进一步，所述步骤(1)中，从栖土曲霉中提取产亮氨酸氨肽酶的基因。
[0026]进一步，所述步骤(2)中，根据GenBank数据库中栖土曲霉基因组测序注释为putative leucine aminopeptidase 2的基因序列，设计出特异性引物，进行合成。
[0027]进一步，所述引物序列如下：
[0028][0029]上下游引物添加保护碱基和酶切位点，其中双下划线部分为保护碱基，单下划线部分为酶切位点，同时在C末端引入6
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His标签。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.产亮氨酸氨肽酶的基因，其特征在于，其碱基序列为SEQ ID NO.1所示。2.产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于，于2022年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2022535；分类命名为：枯草芽孢杆菌WB800/pP43NMK
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lap Bacillus subtilis WB800/pP43NMK
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lap。3.产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，将权利要求1所述的基因转入大肠杆菌质粒E.coli JM109/pP43NMK中，得到重组质粒pP43NMK
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lap，将重组质粒pP43NMK
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lap转入枯草芽孢杆菌B.subtills WB800中，得到重组枯草芽孢杆菌WB800/pP43NMK
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lap。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)产亮氨酸氨肽酶的基因的提取和克隆；(2)重组质粒pP43NMK
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lap的构建；(3)B.subtills WB800感受态制备；(4)重组枯草芽孢杆菌WB800/pP43NMK
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lap的制备。5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海灵，孙利芹，朱雅清，单守水，安志强，李文康，
申请(专利权)人：烟台大学，
类型：发明
国别省市：