一株耐牛胆汁型牛黄转化菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于耐牛胆汁型牛黄转化菌资源开发与利用领域，具体涉及一株耐牛胆汁型牛黄转化菌及其应用。所述的耐牛胆汁型牛黄转化菌的16S rDNA的特征性碱基序列如SEQ No.1所示，特征性碱基位点包括：265

【技术实现步骤摘要】
一株耐牛胆汁型牛黄转化菌及其应用


[0001]本专利技术属于耐牛胆汁型牛黄转化菌资源开发与利用领域，具体涉及一株耐牛胆汁型牛黄转化菌及其应用。

技术介绍

[0002]由于天然牛黄的社会需要量极大，供需矛盾十分突出，为解决这一矛盾，于20世纪50年代研制成功人工合成牛黄，而人工牛黄属于配方牛黄，多数情况不能替代天然牛黄。为此，上世纪90年代蔡红娇教授首先研制成了体外培育牛黄（CN1022668C，CN1044402A，CN1041105A），并收录于中国药典（2020版）中。体外培育牛黄是模拟病理条件下牛胆结石形成过程，应用牛胆汁与微生物共培养转化形成，其化学成分与临床功效与天然牛黄相近，多数情况可等同于天然牛黄入药和临床应用。
[0003]体外培育牛黄作为中成药原料、保健品原料，以及中药饮片，具有巨大市场需求空间和广阔开发前景。目前仅有武汉健民大鹏独家生产体外培育牛黄，从其专利文献看，其生产的体外培育需要通过额外添加大量的复合胆红素钙盐与胆汁酸来满足药典的质量检测指标的含量要求，这导致生产成本高昂，成品的市场价格极其昂贵，超过天然牛黄的三分之一，这也反映出其生产菌种的胆红素和胆汁酸的生物转化效率不高。
[0004]菌种是体外培育牛黄成黄的关键，不是任何细菌都能转化牛胆汁形成牛黄；另外牛胆汁具有广谱性抑菌作用，多数肠道细菌不耐受胆汁，不能在胆汁中较长时间的存活，特别是一些高效牛黄转化细菌更是很难存活于胆汁中超过48小时，严重影响牛黄转化的生产效率，直接决定了生产成本，间接影响着体外培育牛黄的市场价格。因此，筛选较长时间耐受牛胆汁且能高效转化成胆结石的菌种，是提高体外培育牛黄生产效率，降低生产成本，实现名贵中药不再昂贵，普惠众生的关键。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对体外培育牛黄存在的问题，筛选得到一株耐牛胆汁型牛黄转化菌，并研究了其牛黄转化能力，获得了高的牛黄转化效率。提高了体外培育牛黄生产效率，降低了生产成本，投放市场，可以实现名贵中药牛黄不再昂贵的目的。
[0006]本专利技术的技术方案如下：一株耐牛胆汁型牛黄转化菌，所述的耐牛胆汁型牛黄转化菌，为牛胆汁柠檬酸杆菌Citrobacter bovis NDZNM
‑
01，其样本于2022年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 24893。
[0007]优选地，所述牛黄转化菌的16S rDNA的特征性碱基序列如SEQ No.1所示。优选地，所述牛黄转化菌的16S rDNA的特征性碱基序列的扩增引物为：正向F引物的碱基序列如SEQ No.2所示；具体为：5
’‑
CGCAAGCCTGATGCAG
‑3’
；反向R引物的碱基序列如SEQ No.3所示；具体为：5
’‑
CTTCGCGTTGCATCGA
‑3’
。
[0008]优选地，所述牛黄转化菌的16S rDNA特征性碱基序列的特征性碱基位点包括：
265
‑
A，275
‑
C，280
‑
G，282
‑
A，537
‑
A，581
‑
A。
[0009]上述耐牛胆汁型牛黄转化菌的鉴定方法，采用上述扩增引物，对照上述特征性碱基位点。
[0010]进一步地，所述牛黄转化菌在纯牛胆汁中存活时间大于9天。
[0011]本专利技术的另一个目的，保护上述耐牛胆汁型牛黄转化菌的应用，应用于体外培育牛黄的培育生产中。
[0012]进一步地，所述牛黄转化菌应用于体外培育牛黄的培育生产的发酵培养条件为：发酵液的pH为6.5
‑
7.5，发酵温度为20
‑
35℃。
[0013]进一步地，所述牛黄转化菌应用于体外培育牛黄的培育生产中的菌种扩大培养的培养基原料包括：胰蛋白胨、牛肉膏、氯化钠；根据琼脂粉的加入多少配制半固体培养基和固体培养基。
[0014]本专利技术的有益效果：1. 高效转化牛胆汁形成体外培育牛黄的主要药效成分胆红素和胆酸本申请的菌株Citrobacter bovis NDZNM
‑
01在牛胆汁中培养温度为30 ℃培养时，发酵16 d的胆红素与胆酸的含量分别达到2.01
‰
和6.42 %，胆红素含量比天然牛胆汁增加了2.35倍，胆酸含量增加了2.13倍。
[0015]2. 在牛胆汁中的存活时间长由于牛胆汁具有广谱性抑菌作用，多数肠道细菌很难在牛胆汁中存活超过48小时，本申请的菌株Citrobacter bovis NDZNM
‑
01，通过生长曲线测定，在纯牛胆汁中存活时间大于9天，在牛胆汁中发酵温度为30 ℃培养时，48h以内为停滞期，此后便进入了到菌体密度快速增长的对数增长期，培养至96h时菌体密度最大，此后继续培养4 天，菌体密度开始缓慢下降。
[0016]3. 本申请的牛黄转化菌Citrobacter bovis NDZNM
‑
01为一种来源于牛胆汁的特殊的牛胆汁柠檬酸杆菌迄今为止，没有文献报道柠檬酸杆菌能够在牛胆汁中存活，更没有文献报道柠檬酸杆菌的代谢活动能够提高牛胆汁中的胆红素和胆酸的转化效率。
[0017]菌种保藏信息：保藏时间：2022年05月12日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No . 24893；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；分类命名：牛胆汁柠檬酸杆菌Citrobacter bovis。
附图说明
[0018]图1为耐牛胆汁菌株NDZNM
‑
01的形态学观察及其牛黄转化性能；A，耐牛胆汁菌株NDZNM
‑
01的形态特征（放大倍数10
×
40，标尺50μm）；B，耐牛胆汁菌株NDZNM
‑
01发酵牛胆汁形成牛黄颗粒的浑浊液；C，耐牛胆汁菌株NDZNM
‑
01发酵牛胆汁引发牛黄颗粒聚合成牛黄结石的过程；D，耐牛胆汁菌株NDZNM
‑
01发酵牛胆汁引发牛黄颗粒聚合形成牛黄的过程；
图2为耐牛胆汁的牛黄转化菌株NDZNM
‑
01的16SrDNA扩增片段测序结果；图3为基于FastMinimumEvolution法构建的耐牛胆汁的牛黄转化菌株NDZNM
‑
01及其近缘菌株的16SrRNA基因片段序列的无根系统发育树；图4为耐牛胆汁的牛黄转化菌株NDZNM
‑
01在不同发酵胆汁pH值下的牛黄转化率；图5为培养温度对耐牛胆汁的牛黄转化菌株NDZNM
‑
01胆酸转化能力的影响；图6为培养温度对耐牛胆汁的牛黄转化菌株NDZNM
‑
01胆红素转化能力的影响；图7为耐牛胆汁的牛黄转化菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株耐牛胆汁型牛黄转化菌，其特征在于，所述的耐牛胆汁型牛黄转化菌，为牛胆汁柠檬酸杆菌Citrobacter bovis，其样本于2022年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 24893。2.根据权利要求1所述的耐牛胆汁型牛黄转化菌，其特征在于，所述牛黄转化菌的16S rDNA的特征性碱基序列如SEQ No.1所示。3.根据权利要求1所述的耐牛胆汁型牛黄转化菌，其特征在于，所述牛黄转化菌的16S rDNA的特征性碱基序列的扩增引物为：正向F引物的碱基序列如SEQ No.2所示；具体为：5
’‑
CGCAAGCCTGATGCAG
‑3’
；反向R引物的碱基序列如SEQ No.3所示；具体为：5
’‑
CTTCGCGTTGCATCGA
‑3’
。4.根据权利要求2所述的耐牛胆汁型牛黄转化菌，其特征在于，所述牛黄转化菌的16S rDNA特征性碱基序列的特征性碱基位点包括：265
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王厚伟，窦彦玲，王康诚，徐凌川，赵金龙，孙燕，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：