一种简捷高效鉴别制烟原料中烟与非烟的分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种简捷高效鉴别制烟原料中烟与非烟的分子标记及其应用，具体涉及分子生物技术领域。所述分子标记编号为Ntsp043，所述分子标记Ntsp043所对应的引物序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。所述的应用为利用上述烟草属特异性分子标记对涉案制烟原料基因组DNA进行PCR扩增，检测是否存在长度为500bp以上的PCR扩增产物核苷酸序列，由此，可以精确判断该涉案制烟原料中是否有烟草材料存在。本发明专利技术所述的一种烟草属特异性分子标记实现了烟与非烟的快速、有效鉴别检测，提高了涉案制烟原料鉴别检测工作的科学性、准确性和权威性，降低了司法风险，为烟草行业专卖工作中的打假缉私提供强有力的司法证据。中的打假缉私提供强有力的司法证据。中的打假缉私提供强有力的司法证据。

【技术实现步骤摘要】
一种简捷高效鉴别制烟原料中烟与非烟的分子标记及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物
，更具体而言，涉及一种简捷高效鉴别制烟原料中烟与非烟的分子标记及其应用。

技术介绍

[0002]茄科中的绝大部分植物，尤其是烟草属植物，均含有一种特殊的生物碱
‑
烟碱(尼古丁)，故此，烟碱也就成为茄科植物区分其他植物的显著性标志物。目前，国内烟草行业打假缉私工作中的涉案制烟原料鉴别检测采用的化学检验法就是基于上述原理，即，通过测定涉案样品中是否含有烟碱，来判定待测样品是否为烟草专卖品。但烟碱并非烟草独有，许多茄科植物也含有烟碱。此外，受制于仪器检测的灵敏度、烟碱含量水平和检验方法检出限等因素的制约，在多数烤烟中，烟草特有N
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亚硝胺的含量极其低(ng/g水平)，经常出现烤烟样品中检不出烟草特有N
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亚硝胺的情况，因此，依据检测待测物中烟碱和N
‑
亚硝胺含量的化学检验法进行鉴别检测涉案烟草制品存在较高的误判风险，且已经有此类败诉案件的报道，并引发了一定的网络舆情和社会舆情。
[0003]烟草是茄科烟草属中含有特殊生物碱
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烟碱(尼古丁)的草本经济作物，同时也是烟草工业的制烟原料(烟叶)基础。在国内随着中式卷烟的深入发展，制烟原料的基础性地位日益突显，其发展虽有专卖法的保驾护航，但在巨额利益的驱使下，大量涉及制烟原料的打假缉私案件(即，涉案原料中是否有烟草材料检出)仍层出不穷，此既制约着烟草行业的健康、持续发展，又对现行的涉案制烟原料鉴别检验(前罚没烟检验)工作提出新挑战。
[0004]目前，在分子水平上对烟草资源(品种)鉴别检测的研究报道较多，如利用RFLP、RAPD、SSR、ISSR、DArT、SNP等标记对烟草资源(品种)开展遗传多样性分析、指纹图谱构建等研究工作。此外，在已知待测样品属于烟草材料条件下，利用SSR，SCAR和RAPD标记对初烤烟叶进行品种的快速鉴别研究也有少量报道。然而，在分子水平上针对涉案制烟原料鉴别检测方面的研究在国外尚无报道。国内烟草行业针对涉案制烟原料的鉴别检验工作主要采用感观检验法和化学检验法，但该两种方法均存在较明显的缺陷：感观检验法主要依赖检验人员对涉案制烟原料的感观感受和检验经验，易受到检验人员主观感受和经验影响，存在较高比例的误判可能性；化学检验法的主要原理是通过测定待测样品是否含有烟碱进而判定样品是否为烟草专卖品，但烟碱并非烟草所独有，许多非烟草(尤其是茄科)植物也可检出烟碱成分，因此，依据检测待测物中烟碱含量的化学检验法也存在较高的误判风险。
[0005]中国专利CN113549704A(专利号：ZL 2021 1 0558610.3)，是专利技术人之前获得的两个烟草属特异性分子标记编号为Ntsp027和Ntsp151的基因序列，这两个序列是在分子水平上对涉案制烟原料是否为烟草产品进行快速鉴别和检测。该专利基于这两个标记(即，2对引物共含上下游4条核酸序列)及其PCR扩增获得的两个核苷酸序列信息，虽实现了在分子水平上对涉案制烟原料的科学、精准鉴别检测，但该鉴别检测步骤相对复杂、繁琐，需对待测样品分别进行两次PCR体外扩增，且同时检测两次的PCR扩增产物是否同时满足目标条带大小(即，两个PCR扩增产物核苷酸序列信息必须完全吻合才能确定是属于烟草属，有一个
不符合则不属于烟草属)，故此，该专利两个序列局限性偏大，在烟草行业实际的打假缉私工作中耗时多、费力且效率低下。因此找到只需要1对引物，做1次PCR扩增，且仅需检测PCR产物的有无来实现烟与非烟的鉴别检测尤为重要。

技术实现思路

[0006]为此，本专利技术提供一种简捷高效鉴别制烟原料中烟与非烟的分子标记及其应用，以解决目前烟草行业的打假缉私工作中对涉案制烟原料采用感观检验法和化学检验法存在的显著缺陷和不足的问题，同时，也有效弥补了中国专利CN113549704A在分子水平上鉴别检测技术的复杂、繁琐及费时耗力的局限性，进而实现快速、高效、准确的分子鉴别；而实现快速、高效、准确的分子鉴别的关键需科学精准的找到烟草属特异性序列。本专利技术提供一个能够简洁、快速、高效且科学精准的鉴定检测烟与非烟材料的分子标记，仅利用一个标记的PCR扩增产物的有无，即可实现烟草与非烟草材料的鉴别检测。
[0007]为了建立一种科学、高效、简易且基于DNA水平的涉案制烟原料鉴别检验方法，本专利技术利用公共数据库中已知的与烟草烟碱合成、转运、转化及代谢等共计46个相关基因信息，开发了209对烟碱相关引物。同时，结合生物信息学将上述引物与已知茄科植物基因组数据及行业内未公开的烟草基因组数据进行比对，筛选获得同时满足在所有烟草基因组数据中能完全比对且结果唯一，而在除烟草外其余茄科植物基因组中不能比对的候选烟草属特异性引物。再利用108份参试材料对候选烟草属特异性引物进行实验验证，最终获得3个具有烟草属特异性的标记。上述3个标记分别属于2个结构基因(ADC：arginine decarboxylase和A662：A622 mRNA for isoflavone reductase
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like protein)和1个转录因子(Nt ERF189：Nicotiana tabacum ERF189 mRNA for ethylene response factor 189)，其能快速、有效的鉴别检测烟与非烟，首次实现了基于DNA水平的涉案制烟原料鉴别检验。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]根据本专利技术的一方面提供一种简捷高效鉴别制烟原料中烟与非烟的分子标记，所述分子标记编号为Ntsp043，所述分子标记Ntsp043；所对应的引物序列为：
[0010]Ntsp043F：5
’‑
AACAGAACGGGACAATCAGC
‑3’
；SEQ ID No.1；
[0011]Ntsp043R：5
’‑
GTTTGGGATGGAACCAAGTG
‑3’
；SEQ ID No.2；
[0012]根据本专利技术的另一方面提供一种简捷高效鉴别制烟原料中烟与非烟的分子标记在烟草属鉴别的应用。
[0013]进一步的，包括：
[0014]步骤一，提取待测样品基因组DNA；
[0015]步骤二，以步骤一提取的DNA为模板，采用引物Ntsp043，进行PCR扩增反应；
[0016]步骤三，通过电泳检测步骤二中PCR扩增结果：
[0017]利用引物Ntsp043对参试材料进行PCR扩增时，若PCR扩增产物中含有PCR扩增核苷酸片段时，则表明待测样品为烟草样品；
[0018]若PCR扩增产物中无任何PCR扩增核苷酸片段，则表明待测样品为非烟草样品。
[0019]该部分PCR扩增产物核苷酸片段为500bp以上。
[0020]进一步的，所述提取待测样品基因组DNA的方法为滤柱法。
[0021]进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种简捷高效鉴别制烟原料中烟与非烟的分子标记，其特征在于，所述分子标记编号为Ntsp043，所述分子标记Ntsp043所对应的引物序列为：Ntsp043F：5
’‑
AACAGAACGGGACAATCAGC
‑3’
；SEQ ID No.1Ntsp043R：5
’‑
GTTTGGGATGGAACCAAGTG
‑3’
；SEQ ID No.2。2.权利要求1所述一种简捷高效鉴别制烟原料中烟与非烟的分子标记在烟草属鉴别的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：步骤一，提取待测样品基因组DNA；步骤二，以步骤一提取的DNA为模板，采用引物Ntsp043，进行PCR扩增反应；步骤三，通过电泳检测步骤二中PCR扩增结果：利用引物Ntsp043对待测材料进行PCR扩增时，若PCR扩增产物中含有500bp以上的PCR扩增核苷酸片段时，则表明待测样品为烟草样品；若PCR扩增时，产物中无PCR扩增核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：张轲，童治军，王春琼，陈丹，肖炳光，孙浩巍，龙杰，张晓伟，蔡洁云，张冀武，李海燕，李郸，方敦煌，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：