一种水牛骨骼肌特异高效启动子及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种水牛骨骼肌特异高效启动子及其筛选方法和应用。本发明专利技术通过高通量测序分析及qRT

【技术实现步骤摘要】
一种水牛骨骼肌特异高效启动子及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种水牛骨骼肌特异高效启动子及其筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]启动子(Promoter)是DNA上的一段碱基序列，位于结构基因的上游，是基因的重要组成部分。基因的转录由启动子驱动，RNA聚合酶识别并结合启动子序列，调控转录起始过程。启动子作为顺式作用元件，在基因表达调控中发挥重要作用。启动子自身并不能控制基因表达，需要与特定的转录因子结合才能发挥调控作用，决定基因转录的起始点和频率。启动子活性是指在生物体内使下游基因转录形成RNA的能力，受到顺式作用元件以及反式作用因子等因素的影响。在生物体内，启动子元件多，结构较为复杂，获得正确的启动子序列并分析启动子活性是研究基因表达调控的的基础。
[0003]在动物遗传改良中，为使插入的外源目标基因能够在肌肉组织中特异高效表达，则需要在外源基因的上游插入肌肉组织特异高效启动子序列。我国拥有丰富的水牛资源，历史上以役用为主。随着农业机械化水平提高，水牛的役用价值持续降低，需向肉用方向转型。然而，水牛肌肉内脂肪沉积能力差，导致其肉品质不如黄牛。肌内脂肪可显著提高肉的风味、口感和多汁性。在生产上，人们希望在提高肌内脂肪沉积的同时，不影响甚至降低其他部位的脂肪沉积，因为其他部位脂肪沉积对于生产是一种浪费。因此，筛选鉴定水牛骨骼肌特异高效启动子对水牛肉品质的定向改良具有重要的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术公开一种水牛骨骼肌特异高效启动子及其筛选方法和应用，可为水牛肉品质的定向改良研究提供强有力分子工具。
[0005]本专利技术首先提供提供了一种水牛骨骼肌特异高效启动子，该启动子位于为VGLL2基因上游11bp～432bp区域，其序列如SEQ ID NO:1所示。
[0006]扩增上述水牛骨骼肌特异高效启动子的特异性引物对，上游引物为：5
’‑
CGGGGTACCCGAGCGCAGAGACTCTCCTT
‑3’
，如SEQ ID NO:4所示，下游引物为：5
’‑
CCGCTCGAGCTCCCGCTAGTGGGCATTT
‑3’
，如SEQ ID NO:5所示。
[0007]本专利技术还提供了上述水牛骨骼肌特异高效启动子的筛选方法，包括以下内容：
[0008]分析筛选水牛骨骼肌转录组测序数据集，获得水牛骨骼肌特异表达基因；
[0009]利用qRT
‑
PCR方法进行验证，获得水牛骨骼肌特异高表达基因；
[0010]利用NCBI数据库中水牛基因组序列获得候选基因转录起始位点上游序列，设计PCR引物克隆获得不同截短片段的拟启动子，双荧光素酶报告基因系统检测不同截短片段的转录活性，最终获得水牛骨骼肌特异高效启动子。
[0011]具体包括以下步骤：
[0012]步骤1：分析筛选水牛骨骼肌转录组测序数据集，获得12个在水牛肌肉中特异高表
达的基因，具体为CACNG1、CACNG6、MYOG、VGLL2、MYOD1、KCNA7、DUPD1、PRR32、、IGFN1、ACTN3、PITX3、MURC。
[0013]步骤2：qRT
‑
PCR检测12个候选基因在水牛不同发育时期(胎牛、小牛、成年牛)以及不同组织器官(心肌、肝、脾、肺、肾、背最长肌)中的表达水平，同时结合转录测序数据集中候选基因的表达水平，确定水牛骨骼肌特异高表达基因为VGLL2和CACNG1。
[0014]步骤3：根据NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中水牛VGLL2和CACNG1基因的上游序列，设计拟启动子区不同截短片段的PCR克隆引物。
[0015]步骤4：提取水牛基因组DNA，PCR克隆获得水牛骨骼肌特异高表达基因VGLL2和CACNG1上游拟启动子区的9个不同截短片段。
[0016]步骤5：将VGLL2和CACNG1上游拟启动子区的不同截短片段连接到pGL3
‑
Basic载体上，共构建了9个pGL3
‑
Basic重组质粒，pGL3
‑
Basic重组质粒序列经测序验证正确。
[0017]步骤6：复苏培养小鼠成肌细胞和水牛骨骼肌细胞。以萤火虫荧光素酶原载体pGL3
‑
Basic和海肾荧光素酶报告基因载体pRL
‑
TK作为阴性对照，将pGL3
‑
Basic重组质粒和海肾荧光素酶报告基因载体pRL
‑
TK共转染小鼠成肌细胞和水牛骨骼肌细胞。
[0018]步骤7：收取转染48h的细胞，分别检测各组别的萤火虫荧光值和海肾荧光值。
[0019]步骤8：数据分析，筛选出水牛骨骼肌特异高表达基因核心启动子区域为VGLL2基因上游11bp～432bp区域，启动子具体序列如SEQ ID NO:1所示。
[0020]分析上述pGL3
‑
Basic重组质粒、海肾荧光素酶报告基因载体pRL
‑
TK共转染小鼠成肌细胞或水牛骨骼肌细胞后萤火虫荧光素酶活性值和海肾荧光素酶活性值，以萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性的比值，即相对活性值来表示启动子活性，通过GraphPad Prism软件进行显著性差异分析可知，含有VGLL2基因上游11bp～432bp区域的pGL3
‑
Basic重组质粒与海肾荧光素酶报告基因载体pRL
‑
TK共转染小鼠成肌细胞和水牛骨骼肌细胞后的相对活性值最高，即启动子活性最高，由此筛选出水牛骨骼肌特异高表达基因核心启动子区域为VGLL2基因上游11bp～432bp区域。
[0021]本专利技术的有益效果为：
[0022]该专利技术提供的水牛骨骼肌特异高效启动子可应用于外源目标基因在水牛肌肉组织中特异高效表达。
附图说明
[0023]图1为qRT
‑
PCR检测12个候选基因在水牛不同发育时期以及不同组织器官中的表达量分析图。
[0024]图2为CACNG1、VGLL2、PRR32、MURC 4个候选基因转录组测序表达分析图。
[0025]图3为拟启动子区不同截短片段PCR克隆产物的琼脂糖凝胶电泳胶图。
[0026]图4为CACNG1不同截短的拟启动子片段活性分析图。
[0027]图5为VGLL2不同截短的拟启动子片段活性分析图。
[0028]图6为CACNG1
‑
532和VGLL2
‑
581拟启动子片段的验证分析图。
[0029]图7为CACNG1
‑
532和VGLL2
‑
422拟启动子片段的验证分析图。
具体实施方式
[0030]下面通过具体实施方式对本专利技术进行更加详细的说本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水牛骨骼肌特异高效启动子，其特征在于，所述启动子的序列如SEQ ID NO:1所示。2.含有权利要求1所述的水牛骨骼肌特异高效启动子的重组载体。3.扩增权利要求1所述的一种水牛骨骼肌特异高效启动子的特异性引物对，其特征在于，上游引物为：5
’‑
CGGGGTACCCGAGCGCAGAGACTCTCCTT
‑3’
；下游引物为：5
’‑
CCGCTCGAGCTCCCGCTAGTGGGCATTT
‑3’
。4.权利要求1所述的水牛骨骼肌特异高效启动子的筛选方法，其特征在于，分析筛选水牛骨骼肌转录组测序数据集，获得水牛骨骼肌特异表达基因；利用qRT
‑
PCR方法进行验证，获得水牛骨骼肌特异高表达基因；利用NCBI数据库中水牛基因组序列获得候选基因转录起始位点上游序列，设计PCR引物克隆获得不同截短片...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄洁萍，郭朵，冯雪，朱锐锐，石德顺，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：