一种高效表达外源蛋白的CHO细胞株的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种高效表达外源蛋白的CHO细胞的构建方法及其应用，其中，所述方法包括：步骤(1)在外源蛋白序列N端添加信号肽序列；步骤(2)将添加所述信号肽序列的所述外源蛋白与Fc通过融合连接在一起，构建表达质粒；步骤(3)将所述步骤(2)构建的表达质粒转染CHO细胞；以及步骤(4)外源蛋白的收获。本发明专利技术还涉及使用所构建的CHO细胞表达外源蛋白的方法，以及包括该外源蛋白的疫苗组合物。该外源蛋白的疫苗组合物。

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达外源蛋白的CHO细胞株的构建方法及其应用
[0001]本申请是中国专利申请号202010055178.1，申请日2020年01月17日，专利技术名称是“一种高效表达外源蛋白的CHO细胞株的构建方法及其应用”的中国专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术属于细胞系及其制备方法领域，特别涉及经引入外来遗传物质而修饰的细胞及其构建方法和应用。

技术介绍

[0003]CHO细胞是从成年雌性仓鼠卵巢中分离获得，为上皮贴壁细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。相对于其他的表达系统，它有如下优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于真核生物天然蛋白；(2)既可贴壁生长，又可悬浮培养，且耐受较高的剪切力和渗透压；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物的分离纯化。
[0004]然而，如何提高CHO表达系统表达外源蛋白的表达量一直是国内外学者研究的方向，多数是针对具体外源基因进行特定改造来实现提高外源蛋白表达量，不适合其他的外源蛋白的高效表达，当应用到其他的外源蛋白时，需要对其他外源蛋白的基因重新进行改造，程序繁琐。因此，现实生产中需要一种适用于不同外源蛋白的，操作简单的高效表达方法。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术提供一种高效表达外源蛋白的CHO细胞构建方法，其中，所述方法包括：步骤(1)在外源蛋白序列N端添加信号肽序列；步骤(2)将添加信号肽序列的外源蛋白序列与Fc序列通过融合连接在一起，构建表达质粒；步骤(3)将所述步骤(2)构建的表达质粒转染CHO细胞；以及步骤(4)外源蛋白的收获。
[0006]在步骤(4)中，包括筛选产量较高的克隆株；对所得克隆株进行稳定性评估和产率评估，以便选择稳定性较好且细胞生长特性好、蛋白产量较高的克隆株用于生产。
[0007]本专利技术方法使得外源蛋白高效表达，能较CHO常规表达显著提高外源蛋白的表达量，且本专利技术方法可应用到多种外源蛋白的高效表达，可广泛适用于多种兽医疫苗蛋白，无需对外源蛋白的基因进行优化，具有广泛的适用范围。
[0008]作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术所述CHO细胞构建方法中，所述步骤(1)中信号肽序列如SEQ ID.No.1、SEQ ID.No.2、SEQ ID.No.3、SEQ ID.No.4、SEQ ID.No.5、SEQ ID.No.6、SEQ ID.No.7、SEQ ID.No.8、SEQ ID.No.9、SEQ ID.No.10、SEQ ID.No.11、SEQ ID.No.12、SEQ ID.No.13或SEQ ID.No.14所示。如SEQ ID.No.1、SEQ ID.No.2、SEQ ID.No.3、SEQ ID.No.4、SEQ ID.No.5、SEQ ID.No.6、SEQ ID.No.7、SEQ ID.No.8、SEQ ID.No.9、SEQ ID.No.10、SEQ ID.No.11、SEQ ID.No.12、SEQ ID.No.13或SEQ ID.No.14所示
的信号肽可以任选地应用到高效表达某种特定外源蛋白的CHO细胞构建方法中，不限于各个实施例所使用的特定的信号肽序列。
[0009]作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术所述CHO细胞构建方法中，所述步骤(2)中Fc序列如SEQ ID.No.15或SEQ ID.No.16所示。如SEQ ID.No.15所示的Fc序列和如SEQ ID.No.16所示的Fc序列可以任选地应用到高效表达某种特定外源蛋白的CHO细胞构建方法中，不限于各个实施例所使用的特定的Fc序列。
[0010]作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术所述CHO细胞构建方法中，所述步骤(1)中所述外源蛋白基因包括非洲猪瘟病毒CD2v蛋白、禽腺病毒Penton蛋白、禽腺病毒Fiber
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2蛋白、禽减蛋综合征病毒Penton蛋白、禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白、猪圆环病毒3型Cap蛋白、猪圆环病毒2型Cap蛋白、猪伪狂犬病病毒gB蛋白、猪伪狂犬病病毒gD蛋白、猪细小病毒VP2蛋白、猪瘟病毒E2蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白、口蹄疫病毒VP0蛋白、口蹄疫病毒VP3蛋白、口蹄疫病毒VP1蛋白、兔瘟病毒VP60蛋白、日本血吸虫GALE蛋白、日本血吸虫Wnt5蛋白。
[0011]本专利技术还涉及所述的方法制备/构建的高效表达外源蛋白的CHO细胞。
[0012]本专利技术还涉及一种高效表达外源蛋白的方法，其中，所述方法使用所述的CHO细胞表达所述外源蛋白。
[0013]本专利技术还涉及所构建的CHO细胞在制备外源蛋白中的应用。
[0014]本专利技术还涉及所述高效表达外源蛋白的方法在制备外源蛋白中的应用。
[0015]本专利技术还涉及一种疫苗组合物，包括上述方法制备的外源蛋白，以及药学上可接受的载体。特别地，所述疫苗组合物是亚单位疫苗组合物。
[0016]本专利技术制备方法制备的外源蛋白，在生物安全性上、免疫原性和免疫效力、对动物的生长发育无不良反应，可以制备亚单位疫苗。
[0017]作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的疫苗组合物中，所述载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、嵌段共聚物(Block co
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polymer)、SAF
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M、单磷酰脂质A、Avridine脂质
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胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS
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21、GPI
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0100。
[0018]所述佐剂含量为5％
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70％V/V。
[0019]所述佐剂的含量可以任意选自5％V/V、6％V/V、7％V/V、8％V/V、9％V/V、10％V/V、15％V/V、20％V/V、25％V/V、30％V/V、35％V/V、40％V/V、45％V/V、50％V/V、55％V/V、60％V/V、65％V/V、66％V/V、67％V/V、70％V/V。
[0020]本专利技术还涉及所述制备的外源蛋白制备的疫苗组合物，使用本专利技术上述方法制备的外源蛋白，加入药学上可接受的载体，制备亚单位疫苗组合物。
[0021]本专利技术的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。油佐剂既可以是自然来源，也可以是经过人工合成获得的。术语“佐剂”指加入到本专利技术的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达外源蛋白的CHO细胞的构建方法，其中，所述方法包括：步骤(1)在外源蛋白序列N端添加信号肽序列；步骤(2)将添加所述信号肽序列的所述外源蛋白序列与Fc序列通过融合连接在一起，构建表达质粒；步骤(3)将所述步骤(2)构建的表达质粒转染CHO细胞；以及步骤(4)所述外源蛋白的收获。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(1)中信号肽序列如SEQ ID.No.1、SEQ ID.No.2、SEQ ID.No.3、SEQ ID.No.4、SEQ ID.No.5、SEQ ID.No.6、SEQ ID.No.7、SEQ ID.No.8、SEQ ID.No.9、SEQ ID.No.10、SEQ ID.No.11、SEQ ID.No.12、SEQ ID.No.13或SEQ ID.No.14所示。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(2)中Fc序列如SEQ ID.No.15或SEQ ID.No.16所示。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(1)中所述外源蛋白基因包括非洲猪瘟病毒CD2v蛋白、禽腺病毒Penton蛋白、禽腺病毒Fiber
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2蛋白、禽减蛋综合征病毒Penton蛋白、禽减蛋综合征病毒tFiber蛋白、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白、猪圆环病毒3型Cap蛋白、猪圆环病毒2型Cap蛋白、猪伪狂犬病病毒gB蛋白、猪伪狂犬病病毒gD蛋白、猪细小病毒VP2蛋白、猪瘟病毒E2蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白、口蹄疫病毒VP0蛋白、口蹄疫病毒VP3蛋白、口蹄疫病毒VP1蛋白、兔瘟病毒VP60蛋白、日本血吸虫GALE蛋白、日本血吸虫Wnt5蛋白。5.通过权利要求1
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4任一项所述的方法构建的表达外源蛋白的CHO细胞。6.一种表达外源蛋白的方法，其中，所述方法使用权利要求5所述的CHO细胞表达所述外源蛋白。7.权利要求5所述的CHO细胞或者权利要求6所述方法在制备外源蛋白中的应用。8...

【专利技术属性】
技术研发人员：田克恭，谭菲菲，张许科，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：