本发明专利技术提供了一种高表达H1R和H2R的重组HEK293细胞的构建方法及其应用，该方法通过将组胺H1受体和H2受体转染HEK293细胞，使其过表达H1R和H2R，同时将G蛋白偶联受体3个亚型的相应元件MRE/CRE/SRE构建报告基因质粒转染HEK293细胞，并加压筛选分离培养出单克隆细胞株，获得高表达H1R和H2R的重组HEK293细胞，同时基于这一重组HEK293细胞建立的组胺检测方法可进行高通量检测，可以在实验室检测阶段及时准确的发现药品安全风险，保障药品安全，同时还可指导生产企业优化生产工艺，提升药品质量和产品的市场竞争力。量和产品的市场竞争力。量和产品的市场竞争力。
【技术实现步骤摘要】
一种高表达H1R和H2R的重组HEK293细胞的构建方法及其应用
[0001]本专利技术涉及细胞生物学
，具体地涉及一种高表达H1R和H2R的重组HEK293细胞的构建方法及其应用。
技术介绍
[0002]组胺杂质是导致药品在临床使用中出现低血压、过敏反应皮疹、头痛、水肿甚至休克的主要原因，由于其本身即为活性胺类物质，可直接作用于人体细胞或受体，因此其导致的不良反应发生大多较为迅速，极易引发严重的系统性心血管不良反应，甚至危及生命。
[0003]现行的《中国药典》中组胺的检测方法为通则1145和1146中的猫血压测定法和豚鼠离体回肠收缩测定法，这两种方法均为动物源性检测模型，且均为半定量的检测方法，是通过比较药物和某一特定浓度标准品引起猫血压下降的程度或豚鼠离体回肠收缩的程度来测定药物中含有的组胺是否超过限度，但是存在既无法用于组胺的鉴别定性又无法准确定量等缺点，已逐渐无法满足日益严格的药品质量和安全监管的需求。
[0004]组胺受体是一类G蛋白偶联受体，其中组胺作为其内源性配体。有四种已知的组胺受体：H1受体，H2受体，H3受体，H4受体。其中人体血管上分布的主要为H1受体和H2受体(H1R和H2R)，因此H1R和H2R的激活与组胺导致的临床不良反应密切相关。虽然现有的肥大细胞或巨噬细胞等细胞中也表达H1R和H2R，但一方面是由于其表达量不高，另一方面是该类细胞中还存在可介导与组胺不良反应信号通路类似的其他受体，会干扰组胺的检测的专属性，导致这类细胞不能用于组胺检测模型的建立，实现组胺的高通量特异性检测。
技术实现思路
[0005]基于上述问题，本专利技术通过将组胺H1受体和H2受体(H1R和H2R)转染HEK293细胞，使其过表达H1R和H2R，同时将G蛋白偶联受体3个亚型(Gs、Gi和Gq)的相应元件MRE/CRE/SRE构建报告基因质粒转染HEK293细胞，并加压筛选分离培养出单克隆细胞株，获得高表达H1R和H2R的重组HEK293细胞，同时基于这一重组HEK293细胞建立相应的检测方法对组胺进行检测。
[0006]本专利技术的高表达H1R和H2R的重组HEK293细胞的构建方法包括以下步骤：
[0007](1)构建hH1R/pCDNA3.1、hH2R/pCDNA3.1和MRE+CRE+SRE
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Luc/pG L4质粒，并进行扩增；
[0008](2)将扩增后的上述质粒转染HEK293细胞；
[0009](3)将转染后的HEK293细胞进行加压筛选，分离单克隆细胞株，获得高表达H1R和H2R的重组HEK293细胞。
[0010]本专利技术通过构建MRE+CRE+SRE
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Luc/pGL4这一质粒报告基因质粒，能够实现hH1R和hH2R受体到报告基因的信号转导。将hH1R/pCDNA3.1、hH2R/pCDNA3.1和MRE+CRE+SRE
‑
Luc/pGL4这3种质粒转染到HEK293工具细胞中，并挑选单克隆，使细胞既能大量表达hH1R和hH1R用于组胺的识别和结合，又能将信号转导至报告基因，最终转化为可定量检测的化学发光
信号，实现定量检测。
[0011]优选地，所述hH1R/pCDNA3.1质粒的序列如SEQ.ID.No.1所示，所述hH2R/pCDNA3.1质粒的序列如SEQ.ID.No.2所示，所述MRE+CRE+SRE
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Luc/pGL4质粒的序列如SEQ.ID.No.3所示。
[0012]优选地，按照如下方法对hH1R/pCDNA3.1、hH2R/pCDNA3.1和MRE+CR E+SRE
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Luc/pGL4质粒进行扩增：制备大肠杆菌DH5α感受态细胞,将hH1R/pC DNA3.1、hH2R/pCDNA3.1和MRE+CRE+SRE
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Luc/pGL4质粒分别加入感受态细胞中，冰浴、热激，加入无氨苄青霉素抗性LB液体培养基，振摇、离心，将菌体沉淀吹打均匀，加入含有氨苄青霉素抗性LB固体培养基中，过夜培养，挑取单克隆在含有氨苄青霉素抗性LB液体培养基中扩大培养，采用商品化试剂盒获得高纯度质粒，并进行测序验证序列碱基，测序结果与设计序列一致的即为扩增后的质粒。
[0013]优选地，按照如下方法将扩增后的上述质粒转染HEK293细胞：使用Prome ga公司脂质体转染试剂FuGene HD进行转染，将hH1R/pCDNA3.1、hH2R/pC DNA3.1和MRE+CRE+SRE
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Luc/pGL4质粒和FuGene HD加入Opti
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MEM中,轻轻混匀，室温放置一段时间后加入6孔板细胞中，轻轻摇晃混匀，置CO2孵箱中37℃孵育6h，随后用完全培养基替换转染液，继续培养，获得转染后的HEK293细胞。
[0014]优选地，按照如下方法进行加压筛选，分离单克隆细胞株：按比例将转染细胞在6孔板中传代，换为含G418的选择培养基，在6孔板内可见单个细胞，继续培养14天左右，可见单个细胞分裂增殖形成单个抗性集落，抗性集落细胞消化下来后做连续的10倍稀释，将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养，15天左右细胞长满整个孔，胰酶消化，传代至大瓶培养，反复冻存、培养细胞两次。
[0015]本专利技术同时公开了通过上述构建方法得到的高表达H1R和H2R的重组HE K293细胞在组胺检测中的应用。
[0016]优选地，按照如下方法进行组胺检测：
[0017](1)将约2
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105个细胞/ml的高表达H1R和H2R的重组HEK293细胞悬液每孔100μl接种于包被的96孔板中，置于37℃含5％CO2的培养箱中培养6小时，待细胞贴壁后小心吸出完全培养基并加入90μl/孔的无血清培养基，在培养箱中饥饿过夜；
[0018](2)取磷酸组胺22.2mg加入233μl无菌水配置成293mM的组胺储存液，取5μL组胺储存液加入495μL无血清培养基稀释成2.93mM的组胺稀释液，取5μL 2.93mM的组胺稀释液加入495μL无血清培养基稀释成29.3μM的浓缩倍数为10的组胺溶液，随后再用无血清培养基4倍梯度稀释，得到共9个浓度梯度；
[0019](3)取上述9个不同浓度点的浓缩倍数为10的组胺溶液各10μL加入到细胞板的对应组别的孔中，置于37℃含5％CO2的培养箱中孵育7小时，加入Vk ey High
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Glo检测试剂，100μL每孔，震荡3
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5分钟，1000rpm离心1分钟后采用酶标仪检测化学发光值。
[0020]本专利技术确定了构建的细胞模型用于组胺检测的最佳细胞密度、孵育时间，以及可准确测定的组胺浓度范围、检测的灵敏度和特异性等，实现测定方法的标准化。将构建的检测模型应用于实际的药品组胺杂质检测中，验证检测模型对不同类型药物的适用范围，为后续的推广应用打下基础。
[0021]本专利技术提供的高表达H1R和H2R的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高表达H1R和H2R的重组HEK293细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建hH1R/pCDNA3.1、hH2R/pCDNA3.1和MRE+CRE+SRE
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Luc/pGL4质粒，并进行扩增；(2)将扩增后的上述质粒转染HEK293细胞；(3)将转染后的HEK293细胞进行加压筛选，分离单克隆细胞株，获得高表达H1R和H2R的重组HEK293细胞。2.根据权利要求1所述的高表达H1R和H2R的重组HEK293细胞的构建方法，其特征在于：所述hH1R/pCDNA3.1质粒的序列如SEQ.ID.No.1所示，所述hH2R/pCDNA3.1质粒的序列如SEQ.ID.No.2所示，所述MRE+CRE+SRE
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Luc/pGL4质粒的序列如SEQ.ID.No.3所示。3.根据权利要求1所述的高表达H1R和H2R的重组HEK293细胞的构建方法，其特征在于：按照如下方法对hH1R/pCDNA3.1、hH2R/pCDNA3.1和MRE+CRE+SRE
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Luc/pGL4质粒进行扩增：制备大肠杆菌DH5α感受态细胞,将hH1R/pCDNA3.1、hH2R/pCDNA3.1和MRE+CRE+SRE
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Luc/pGL4质粒分别加入感受态细胞中，冰浴、热激，加入无氨苄青霉素抗性LB液体培养基，振摇、离心，将菌体沉淀吹打均匀，加入含有氨苄青霉素抗性LB固体培养基中，过夜培养，挑取单克隆在含有氨苄青霉素抗性LB液体培养基中扩大培养，采用商品化试剂盒获得高纯度质粒，并进行测序验证序列碱基，测序结果与设计序列一致的即为扩增后的质粒。4.根据权利要求1所述的高表达H1R和H2R的重组HEK293细胞的构建方法，其特征在于：按照如下方法将扩增后的上述质粒转染HEK293细胞：使用Promega公司脂质体转染试剂FuGene HD进行转染，将hH1R/pCDNA3.1、hH2R/pCDNA3.1和MRE+CRE+SRE
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Luc/pGL4质粒和FuGene HD加入Opti...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈莉，季文君，顾晓红，潘尔卓，
申请(专利权)人：苏州市药品检验检测研究中心，
类型：发明
国别省市：
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