检测胰腺癌相关基因甲基化的引物、探针、试剂盒及方法技术

本公开提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的引物、探针、试剂盒及方法，涉及生物技术领域。上述检测胰腺癌相关基因甲基化的引物和探针包括检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的引物和探针。通过采用本公开的引物探针组合在进行胰腺癌检测时，显著提高了胰腺癌检测的灵敏性和特异性，可以辅助胰腺癌的早期诊断、预后、治疗反应预测和复发风险评估，在检测结果呈甲基化阴性时，能够避免不必要的镜检，整个过程可以简便的采用外周血体外检测，无创伤、简便易行。简便易行。简便易行。

【技术实现步骤摘要】
检测胰腺癌相关基因甲基化的引物、探针、试剂盒及方法


[0001]本公开涉及生物
，特别涉及一种检测胰腺癌相关基因甲基化的引物、探针、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]胰腺癌是癌症死亡的第四大原因，其中五年的存活率低于5％，预计全球病例数将会不断增加。它的不良预后取决于多种复杂因素，然而一个关键的原因是大多数患者在较晚的阶段被诊断，只有大约20％的患者能够接受手术切除。CA19
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9是一种经典的生物标志物，它被广泛用于胰腺癌的检测。但由于其灵敏度(41
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86％)和特异性(33
‑
100％)较低，尚不够理想。因此，目前亟需开发更有效和可靠的生物标志物来筛查可手术阶段的胰腺癌。
[0003]肿瘤会释放游离核酸片段，包括游离DNA(cfDNA)，以及mRNA和micro(mi)RNAs进入血液，它们被认为是潜在的癌症诊断的生物标志物。肿瘤特异性核酸检测与遗传和表观遗传变化，如突变、拷贝数变化和DNA甲基化，因此可以使用所谓的“液体活检”来诊断和监测肿瘤。表观遗传机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑，被认为与基因表达密切相关并反映肿瘤表型。其中，DNA甲基化标记由于其稳定性被认为是特别有效的临床上的诊断工具。
[0004]目前，早期胰腺癌的诊断“金标准”仍为内镜下组织活检，而在我国大规模开展胰腺癌筛查条件尚不具备，同时也缺乏理想的生化或者生物学标志物检测作为筛查或普查胰腺癌的手段，虽然敏感度及特异度均较高，但由于其有创性、费用较高且部分地区医疗资源有限，故不能作为大规模人群的筛查手段。在胰腺癌患者外周血液循环中的自由DNA分子与胰腺癌的进展程度呈密切的相关性。肿瘤进展程度越晚，血液循环中的肿瘤相关的游离DNA分子越多。为了提高诊断试验的灵敏度，可以通过提高甲基化检测的敏感度来实现。这种易于实施、建立在血液检测基础上的胰腺癌筛查手段，对胰腺癌的早期诊断均具有重要的意义。
[0005]因此，目前亟需一种用于检测胰腺癌相关基因甲基化的引物探针组合。

技术实现思路

[0006]本公开的主要目的在于提供一种检测胰腺癌相关基因甲基化的引物、探针、试剂盒及方法，以克服现有技术中的不足。
[0007]为了实现上述目的，本公开采用了以下的技术方案：
[0008]本公开实施例的第一方面，提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的引物，包括检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的引物，
[0009]检测BNC1基因的引物包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；
[0010]检测NPTX2基因的引物包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；
[0011]检测ADAMTS1基因的引物包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；
[0012]检测PCDH10基因的引物包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物；
[0013]检测DIRAS1基因的引物包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物。
[0014]本公开实施例的第二方面，提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的探针，包括检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的探针，
[0015]检测BNC1基因的探针为SEQ ID NO.11所示的探针；
[0016]检测NPTX2基因的探针为SEQ ID NO.12所示的探针；
[0017]检测ADAMTS1基因的探针为SEQ ID NO.13所示的探针；
[0018]检测PCDH10基因的探针为SEQ ID NO.14所示的探针；
[0019]检测DIRAS1基因的探针为SEQ ID NO.15所示的探针。
[0020]本公开实施例的第三方面，提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物和如上所述的探针。
[0021]在一种实施方式中，所述试剂盒还包括PCR预混液和Tag DNA聚合酶扩增体系。
[0022]本公开实施例的第四方面，提供了一种检测胰腺癌相关基因甲基化的方法，包括：
[0023]S1、提取血浆样本中游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段；
[0024]S2、将所述游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段进行亚硫酸盐转化；
[0025]S3、利用如上所述的引物和如上所述的探针组合成的荧光PCR反应体系对亚硫酸盐转化的游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段进行PCR扩增；
[0026]S4、获取PCR扩增的Ct值，进行结果分析。
[0027]在一种实施方式中，所述提取血浆样本中游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段，具体包括：
[0028]获取外周静脉血；
[0029]从所述外周静脉血中分离血浆，得到血浆样本；
[0030]对所述血浆样本使用核酸提取试剂盒进行提取和纯化，得到游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段。
[0031]在一种实施方式中，所述PCR扩增的反应条件为95℃预变形300s，进行1个循环；95℃变形15s，55℃退火延伸35s，进行45个循环。
[0032]在一种实施方式中，所述PCR扩增时采集FAM、JOE、CY5和Texas Red四种荧光信号。
[0033]在一种实施方式中，所述结果分析，具体包括：
[0034]内参基因的Ct值≤30，BNC1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明BNC1基因检测结果为阳性，BNC1基因发生了甲基化；NPTX2基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明NPTX2基因检测结果为阳性，NPTX2基因发生了甲基化；ADAMTS1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明ADAMTS1基因检测结果为阳性，ADAMTS1基因发生了甲基化；PCDH10基因的Ct值≤32
且有“S”扩增曲线，表明PCDH10基因检测结果为阳性，PCDH10基因发生了甲基化；DIRAS1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明DIRAS1基因检测结果为阳性，DIRAS1基因发生了甲基化；BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因中的至少一个基因检测结果为阳性，则检测结果为甲基化阳性。
[0035]本公开实施例的第五方面，提供了检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测胰腺癌相关基因甲基化的引物，其特征在于，包括检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的引物，检测BNC1基因的引物包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；检测NPTX2基因的引物包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；检测ADAMTS1基因的引物包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；检测PCDH10基因的引物包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物；检测DIRAS1基因的引物包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物。2.一种检测胰腺癌相关基因甲基化的探针，其特征在于，包括检测BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因甲基化的探针，检测BNC1基因的探针为SEQ ID NO.11所示的探针；检测NPTX2基因的探针为SEQ ID NO.12所示的探针；检测ADAMTS1基因的探针为SEQ ID NO.13所示的探针；检测PCDH10基因的探针为SEQ ID NO.14所示的探针；检测DIRAS1基因的探针为SEQ ID NO.15所示的探针。3.一种检测胰腺癌相关基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物和如权利要求2所述的探针。4.根据权利要求3所述的检测胰腺癌相关基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR预混液和Tag DNA聚合酶扩增体系。5.一种检测胰腺癌相关基因甲基化的方法，其特征在于，包括：S1、提取血浆样本中游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段；S2、将所述游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADAMTS1基因、PCDH10基因和DIRAS1基因片段进行亚硫酸盐转化；S3、利用权利要求1所述的引物和如权利要求2所述的探针组合成的荧光PCR反应体系对亚硫酸盐转化的游离的BNC1基因、NPTX2基因、ADA...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵娜，王校，朱艳华，胡长安，宋雅林，胡守旺，史文钊，
申请(专利权)人：神州医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：