具有催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N-去甲莨菪碱的莨菪碱N-去甲酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了具有催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N

【技术实现步骤摘要】
具有催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N
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去甲莨菪碱的莨菪碱N
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去甲酶及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及具有催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N
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去甲莨菪碱的莨菪碱N
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去甲酶，还涉及莨菪碱N
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去甲酶的应用。

技术介绍

[0002]慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是全球发病率和死亡率最高的疾病之一且不可治愈，只能使用药物缓解病症。异丙托溴铵是治疗COPD的特效药，具有作用迅速的特点，常用于COPD急性发作期。COPD患者人数众多和长期用药的现实，导致异丙托溴铵市场需求巨大且价格昂贵，患者用药的经济负担重。目前，异丙托溴铵常采用化学半合成的方法进行生产。异丙托溴铵的生产路线如下：以莨菪碱为起始原料，采用化学方法将其进行N
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去甲基化，生成去甲莨菪碱(Norhyoscyamine)；去甲莨菪碱与2
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溴丙烷、溴甲烷依次发生取代反应，最终生成异丙托溴铵。
[0003]莨菪碱不仅是生产异丙托溴铵的必需原料，也是临床上常用的抗胆碱药物之一。莨菪碱的工业化生产完全依赖于从少数茄科药用植物中提取，这些药用植物包括颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura species)和三分三(Anisodus acutangulus)等。药源植物中莨菪碱含量很低，以规模化种植面积最大的颠茄为例，莨菪碱含量约为叶片干重的0.2％，导致莨菪碱的供应有限，市场价格高。莨菪碱的有限生产现状是导致异丙托溴铵价格高昂的主要原因之一；采用化学手段将莨菪碱转化为去甲莨菪碱的过程中，其得率不高、副产物较多，进一步导致异丙托溴铵生产成本居高不下。
[0004]降低丙托溴铵生产成本的关键环节是同时提高莨菪碱和去甲莨菪碱的生产效率。因此，研究人员探索利用植物代谢工程技术，以实现在植物中将将莨菪碱高效率转化为去甲莨菪碱的方法。例如，在植物中过量表达次生代谢生物合成途径关键酶基因，能够打破代谢产物合成的限速步骤，从而促进最终有用代谢产物在植物体内的积累，获得更有经济价值的材料。植物代谢工程的应用依赖于次生代谢产物生物合成途径的解析。因此，克隆药源植物中去甲莨菪碱生物合成基因，对于在植物中高效生产去甲莨菪碱具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供具有催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N
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去甲莨菪碱的莨菪碱N
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去甲酶；本专利技术的目的之二在于提供具有催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N
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去甲莨菪碱的莨菪碱N
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去甲酶基因；本专利技术的目的之三在于提供含有编码所述莨菪碱N
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去甲酶的核酸序列的重组载体；本专利技术的目的之四在于提供含有编码所述莨菪碱N
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去甲酶的核酸序列的转化体；本专利技术的目的之五在于提供所述莨菪碱N
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去甲酶或所述莨菪碱N
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去甲酶基因在提高茄科植物中N
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去甲莨菪碱含量中的应用；本专利技术的目的之六在于提供含有编码所述莨菪碱N
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去甲酶基因的重组载体在提高茄科植物中N
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去甲莨菪碱含量中的应用；本专利技术的目的之七在于提供所述莨菪碱N
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去甲酶作为催化莨菪碱发生脱甲基反应生
成N
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去甲莨菪碱的催化剂中的应用。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]1、具有催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N
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去甲莨菪碱的莨菪碱N
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去甲酶，所述莨菪碱N
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去甲酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008]2、具有催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N
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去甲莨菪碱的莨菪碱N
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去甲酶基因，所述莨菪碱N
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去甲酶基因的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009]3、含有编码所述莨菪碱N
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去甲酶的核酸序列的重组载体。
[0010]4、含有编码所述莨菪碱N
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去甲酶的核酸序列的转化体。
[0011]5、所述莨菪碱N
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去甲酶或所述莨菪碱N
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去甲酶基因在提高茄科植物中N
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去甲莨菪碱含量中的应用。
[0012]本专利技术优选的，所述茄科植物为颠茄、曼陀罗或三分三。
[0013]6、含有编码所述莨菪碱N
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去甲酶基因的重组载体在提高茄科植物中N
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去甲莨菪碱含量中的应用。
[0014]本专利技术优选的，所述重组载体是以编码所述莨菪碱N
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去甲酶的核酸序列替换pBI121上GUS基因得到。
[0015]7、所述莨菪碱N
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去甲酶作为催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N
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去甲莨菪碱的催化剂中的应用。
[0016]本专利技术优选的，所述催化发生在宿主细胞内，或体外化学合成。
[0017]本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了具有催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N
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去甲莨菪碱的莨菪碱N
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去甲酶莨菪碱N
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去甲酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码所述莨菪碱N
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去甲酶的核酸序列如SEQ ID NO.3所示；经研究发现该酶具有催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N
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去甲莨菪碱，并能在转基因植物中提高N
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去甲莨菪碱的含量，因此可用于代谢工程提高茄科植物中N
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去甲莨菪碱，也可在化学合成中作为催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N
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去甲莨菪碱的催化剂，为异丙托溴铵的制备提供更高效的原料。
附图说明
[0018]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：
[0019]图1为莨菪碱质谱检测结果；
[0020]图2为去甲莨菪碱质谱检测结果；
[0021]图3为转基因颠茄毛状根采用荧光定量PCR进行检测结果(Control为对照，OE1、OE2、OE3分别为不同转基因株系)；
[0022]图4为去甲莨菪碱含量检测结果(Control为对照，OE1、OE2、OE3分别为不同转基因株系)。
具体实施方式
[0023]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0024]实施例1、莨菪碱N
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去甲酶(hyoscyamine N
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demethylase，H本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N
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去甲莨菪碱的莨菪碱N
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去甲酶，其特征在于：所述莨菪碱N
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去甲酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.具有催化莨菪碱发生脱甲基反应生成N
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去甲莨菪碱的莨菪碱N
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去甲酶基因，其特征在于：所述莨菪碱N
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去甲酶基因的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.含有编码权利要求1所述莨菪碱N
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去甲酶的核酸序列的重组载体。4.含有编码权利要求1所述莨菪碱N
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去甲酶的核酸序列的转化体。5.权利要求1所述莨菪碱N
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去甲酶或权利要求2所述莨菪碱N
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【专利技术属性】
技术研发人员：邱飞，廖志华，陈敏，杨春贤，孙秀丽，
申请(专利权)人：西部重庆科学城种质创制大科学中心，
类型：发明
国别省市：