一种基因编辑间充质干细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种基因编辑间充质干细胞及其制备方法与应用，涉及生物医药技术领域。本发明专利技术的一种基因编辑间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：将STAT3启动子与UBE3A片段连接，构建慢病毒表达载体；将慢病毒表达载体转染间充质干细胞，筛选得到所述基因编辑间充质干细胞。本发明专利技术制备得到的基因编辑间充质干细胞高表达UBE3A，促进METTL1的泛素化和METTL1蛋白质的降解，能够促进间充质干细胞向成软骨方向分化的效率，为骨关节炎软骨的修复提供一种新的治疗途径。种新的治疗途径。种新的治疗途径。

【技术实现步骤摘要】
一种基因编辑间充质干细胞及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物药物
，具体涉及一种基因编辑间充质干细胞及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]骨关节炎又称退行性骨关节炎、骨关节病，主要是指关节软骨随着年龄的增长，或因劳损、活动量的增多、过多，引起关节软骨的退变、磨损，软骨下骨的裸露。目前治疗骨关节炎的方法主要分为非手术治疗和手术治疗。非手术治疗以疼痛管理为主，通过非甾体类抗炎药、关节内透明质酸、糖皮质激素等的应用，减轻关节疼痛和炎症反应。而手术治疗最常见的方法是人工关节置换术。人工关节置换术可以缓解患者症状，可以有效地恢复关节功能，提高患者生活质量。非手术治疗仅解决疼痛和炎症问题，但无法解决其他问题。手术治疗无法解决软骨受损导致的关节完整性缺失问题。且手术治疗过程中，手术费用较高，给病人家庭及社会医疗资源造成严重压力；同时由于不是本体组织，人工关节不能与自身骨骼系统融为一体，不可避免的会发生假体松动、下沉等远期并发症，导致手术失败，需二次翻修手术，增加了社会效益和经济效益。
[0003]间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)具有多向分化的潜能，其可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、软骨细胞等多种细胞，是目前组织工程理想的种子细胞。与其他组织来源的MSCs一样，骨髓来源的间充质干细胞(Bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)也具有多种分化能力。临床上若使用自体骨髓间充质干细胞引入关节腔内进行相关治疗，为临床上OA的治疗提供了更多可能性。
[0004]越来越多的研究表明，炎症机制在骨关节炎的发生和发展中起着重要作用，其通过调控炎症细胞因子及相关信号通路，引起细胞外基质的降解和软骨细胞的功能障碍，最终导致骨关节炎的发生。我们的研究亦证实，OA动物模型中关节液内IL
‑
6的表达显著升高，结合近年来兴起的干细胞基因编辑技术，将为针对骨关节炎的干细胞定向分化治疗带来希望。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基因编辑间充质干细胞及其制备方法与应用。本专利技术基于OA动物模型中关节液内IL
‑
6的表达显著升高，借助IL6/JAK/STAT3信号通路，将STAT3连接至UBE3A上游，制备一种基因编辑间充质干细胞。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种基因编辑间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：将STAT3启动子与UBE3A片段连接，构建慢病毒表达载体；将慢病毒表达载体转染间充质干细胞，筛选得到所述基因编辑间充质干细胞。Janus激酶/信号转导和转录活化因子(Janus Kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)是目前临床研究较多的信号通路，本通路有多种蛋白调节酶，主要介导信号转导以及基因转录和活化，最终介导靶基因激活的作用。本申请专利技术人研究发现，OA大鼠关节液
IL
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6的表达显著升高，导致STAT3磷酸化并促进其入核。在此基础上，本专利技术将STAT3启动子连接至UBE3A上游，构建得到p
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STAT3
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UBE3A载体，并采用该载体转染间充质干细胞，获得基因编辑间充质干细胞p
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STAT3
‑
UBE3A
‑
MSC，该细胞对骨关节炎具有良好的修复作用。
[0007]作为本专利技术所述基因编辑间充质干细胞的制备方法的优选实施方式，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
[0008]本专利技术还提供一种基因编辑间充质干细胞，采用所述的基因编辑间充质干细胞的制备方法制备得到。
[0009]作为本专利技术所述的基因编辑间充质干细胞的优选实施方式，所述基因编辑间充质干细胞在IL
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6或OA关节液刺激下向成软骨分化。
[0010]作为本专利技术所述的基因编辑间充质干细胞的优选实施方式，所述基因编辑间充质干细胞中UBE3A表达上调。
[0011]作为本专利技术所述的基因编辑间充质干细胞的优选实施方式，所述基因编辑间充质干细胞中METTL1表达下调。
[0012]本专利技术还提供一种用于治疗骨关节炎的药物组合物，包括所述的基因编辑间充质干细胞和药学上可接受的载体。
[0013]本专利技术还提供所述的基因编辑间充质干细胞在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
[0014]本专利技术还提供敲低METTL1的骨髓间充质干细胞在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
[0015]本专利技术还提供过表达UBE3A的骨髓间充质干细胞在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。泛素
‑
蛋白酶体途径是调节多种细胞生物学过程的重要机制，介导了真核生物体内80％
‑
85％的蛋白质降解。而介导这一过程的关键是泛素蛋白连接酶(E3)，UBE3A(E6
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AP)是泛素蛋白连接酶(E3)家族的重要成员之一，最初发现其泛素连接酶活性是与HPV16编码的E6原癌蛋白形成E6/E6
‑
AP蛋白复合物，通过泛素
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蛋白酶体途径降解P53蛋白，随后研究发现大量的细胞蛋白通过E6
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AP介导的泛素
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蛋白酶体途径降解，如BAK,c
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MYC,Mcm
‑
7,hScrib,HHR23A以及SRC
‑
3等。本申请专利技术人研究发现，UBE3A通过调控METTL1降解促进BMSCs细胞成软骨分化。
[0016]本专利技术的有益效果：本专利技术提供一种基因编辑间充质干细胞，本专利技术的基因编辑间充质干细胞高表达UBE3A，促进METTL1的泛素化和METTL1蛋白质的降解，能够促进间充质干细胞向成软骨方向分化的效率，为骨关节炎软骨的修复提供一种新的治疗途径。
附图说明
[0017]图1为METTL1在对照组以及敲低METTL1的BMSCs中表达情况，其中A为Western Blot检测METTL1蛋白水平的表达；B为qRT
‑
PCR检测METTL1的mRNA水平表达，ACTB作为内参，n＝3,***P<0.001。
[0018]图2为WB检测敲低METLL1及对照组的BMSCs成软骨诱导分化过程中软骨细胞标志物表达变化情况。
[0019]图3：A为免疫共沉淀证实METTL1可以和UBE3A相互作用；B为western法检验UBE3A敲降效率；C为western法检验UBE3A高表达效果；D为WB显示UBE3A敲降后METTL1表达上调，
UBE3A高表达后METTL1表达下降。
[0020]图4为CHX蛋白质合成抑制剂处理后METTL1蛋白水平的变化.
[0021]图5为体外泛素化实验结果图。
[0022]图6为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因编辑间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将STAT3启动子与UBE3A片段连接，构建慢病毒表达载体；将慢病毒表达载体转染间充质干细胞，筛选得到所述基因编辑间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的基因编辑间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。3.一种基因编辑间充质干细胞，其特征在于，采用权利要求1～2任一项所述的基因编辑间充质干细胞的制备方法制备得到。4.根据权利要求3所述的基因编辑间充质干细胞，其特征在于，所述基因编辑间充质干细胞在IL
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6或OA关节液刺激下向成软骨分化。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾彩芳，林冠丽，余蓓信，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：