含蛋白质的溶液的评价方法技术

一种评价含蛋白质的溶液的过滤膜的堵塞的方法，其包括下述工序：工序a)，使含蛋白质的溶液通过过滤膜；工序b)，在工序a)之后，自过滤膜获得过滤膜截面；工序c)，利用对蛋白质的聚集体具有特异性的至少一种染色剂，在工序a)之前对含蛋白质的溶液进行处理，或在工序b)之前对过滤膜进行处理，或在工序b)之后对过滤膜截面进行处理；和工序d)，确认过滤膜截面中的蛋白质的聚集体的存在。白质的聚集体的存在。白质的聚集体的存在。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】含蛋白质的溶液的评价方法


[0001]本专利技术涉及含蛋白质的溶液的评价方法。

技术介绍

[0002]近年，除了源自人的血液的血浆分馏制剂之外，利用了基因重组技术等的生物药物等以蛋白质作为有效成分的制剂的开发也盛行。这些蛋白质制剂由于原料源自生物，因此含有很多杂质，其制造工序中包括多阶段的纯化工序。纯化使用离心分离、膜分离、柱色谱等分离手法，其中，膜分离为可以以各尺寸将杂质分离的有用的手段。
[0003]进行膜分离时的问题之一，可列举出由于过滤中的膜的堵塞所导致的过滤速度降低。膜的堵塞的机理大致存在3种。第一种为完全闭塞这种现象，为大的颗粒堵塞膜孔的现象。第二种为在膜孔的壁面吸附颗粒、该孔变窄的标准闭塞这种现象。第三种为尺寸不大的颗粒在膜表面浓缩、进而堆积，由此成为过滤的阻力的滤饼过滤这种现象(例如参照非专利文献1)。从事纯化工序的技术者为了不会产生这些现象而需要进行膜的选定、过滤条件的研究，实现该工序的效率化。
[0004]现有技术文献
[0005]专利文献
[0006]专利文献1：日本特表2014
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517047号公报
[0007]专利文献2：国际公开第2015/156403号
[0008]非专利文献
[0009]非专利文献1：膜(MEMBRANE),36(5),211
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216(2011)
[0010]非专利文献2：Guidance for Industry Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products(2014、U.S.Department of Health and Human Services Food and Drug Administration)

技术实现思路

[0011]专利技术要解决的问题
[0012]蛋白质有可能由于各种应激反应、刺激而形成聚集体。若蛋白质的聚集体(以下有时简称为“聚集体”)存在则在膜分离时，大的聚集体有可能成为膜完全闭塞的原因。作为纯化工序之一经常使用的利用病毒去除膜的病毒去除工序，为利用膜将目的蛋白质和稍微大于其的病毒分离的技术。因此，若产生目的蛋白质的聚集，则聚集体为病毒去除膜的孔的尺寸以上，有可能产生病毒去除膜的堵塞。
[0013]另外，聚集体通常大多伴随变性，在天然状态下被折叠到蛋白质分子的内侧的疏水氨基酸残基对于变性了蛋白质而言，有可能在表面露出。因此已知聚集体容易吸附于疏水性的膜材料表面，有可能成为膜的标准闭塞的原因。
[0014]为了抑制由于聚集体而产生膜的闭塞，例如在病毒去除膜的前段，利用去除聚集体的膜对含有聚集体的溶液进行处理的对策有可能有效。
[0015]已知若没有变性、聚集的天然状态的蛋白质也与疏水的表面接触，则由于疏水性相互作用、静电相互作用而吸附于膜的表面，该现象显著的状况下产生由于膜的标准闭塞所导致的过滤速度降低。认为蛋白质对膜表面的吸附被溶液的pH、盐的存在影响。例如蛋白质和膜的表面具有相反的电荷的情况下，由于静电相互作用而产生吸附，但是若溶液中存在适当量的盐，则双方的表面电荷被遮蔽、吸附得到缓和。如此，产生标准闭塞的情况下，调整利用病毒去除膜的过滤工序的pH、盐浓度等也有可能是有效的。
[0016]专利文献1公开了，通过多孔的含聚酰胺的成形体，事先对利用病毒去除膜过滤的溶液进行处理，将蛋白质的多聚体等生物体高分子集合体从溶液去除，由此防止病毒去除膜的堵塞的方法。但是，专利文献1没有公开或暗示堵塞存在完全闭塞、标准闭塞和滤饼过滤。另外，专利文献1没有公开或暗示事先确认溶液中的生物体高分子集合体的存在有无的方法。溶液中不存在生物体高分子集合体、病毒去除膜堵塞的原因并非聚集体那样的生物体高分子集合体的情况下，即使事先利用多孔的含聚酰胺的成形体对溶液进行处理、也有可能不能解除病毒去除膜的堵塞。
[0017]专利文献2公开了特定使用尺寸不同的胶体金捕捉病毒去除膜内的各种尺寸的颗粒的位置的方法。但是，专利文献2的方法仅为了特定病毒去除膜中的孔径，而将尺寸已知的胶体金利用病毒去除膜过滤后，确认病毒去除膜中的捕捉胶体金的位置。因此，专利文献2没有公开或暗示将聚集体的存在、聚集体的量、聚集体的尺寸和聚集体的形状等未知的含蛋白质的液体利用病毒去除膜过滤后、该病毒去除膜堵塞的情况下，特定堵塞的原因的方法。
[0018]另外，若聚集体残留于最终制剂则存在对患者造成副作用的风险，因此，各国监管当局对于其分析公布指导方针。如非专利文献2中例示那样，认为在药物产业中，尺寸排阻色谱为聚集体的分析的主要手段，但是其定量极限为数μg/mL左右。但是，病毒去除膜即使此以下的量的聚集体也有可能产生堵塞。分析超离心法为最近使用的技术，检出蛋白质的原理与尺寸排阻色谱同样地基于紫外吸光度，因此认为分析超离心法的定量极限程度与尺寸排阻色谱相同。如此，在生物药物的制造工序中，确认特别是处于供于病毒去除工序的阶段的含蛋白质的溶液中是否存在蛋白质的聚集体并非容易。
[0019]因此，以往特定过滤膜中产生的堵塞现象的原因是困难的。因此，本专利技术的目的之一在于，提供在含蛋白质的溶液的过滤中产生过滤膜的堵塞时，特定其原因是否为聚集体的方法。
[0020]用于解决问题的方案
[0021]本专利技术人等认为，若可以知道在产生膜的堵塞问题时、其原因是否为聚集体，则得到对于该工序改善有用的信息，并进行了研究。即本专利技术人等发现，若可知堵塞的原因为聚集体则例如通过事先去除聚集体等可以解决问题。另外本专利技术人等发现，若可知堵塞的原因并非聚集体则通过其他手段可以解决问题。若膜堵塞的原因不清楚则需要进行各种堵塞的对策、证实各自的抑止效果。但是，若膜堵塞的原因清楚则能够预测必要的对策和其效果。
[0022]根据本专利技术的方式，提供一种评价含蛋白质的溶液的过滤膜的堵塞的方法，其包括下述工序：
[0023]工序a)，使含蛋白质的溶液通过过滤膜；
[0024]工序b)，在工序a)之后，自过滤膜获得过滤膜截面；
[0025]工序c)，利用对蛋白质的聚集体具有特异性的至少一种染色剂，在工序a)之前对含蛋白质的溶液进行处理，或在工序b)之前对过滤膜进行处理，或在工序b)之后对过滤膜截面进行处理；和
[0026]工序d)，确认过滤膜截面中的蛋白质的聚集体的存在。
[0027]根据本专利技术的方式，提供一种评价含蛋白质的溶液的过滤膜的堵塞的方法，其包括下述工序：
[0028]工序a)，使含蛋白质的溶液通过过滤膜；
[0029]工序a
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1)，在工序a)中确认过滤膜的堵塞；
[0030]工序b)，在工序a)之后，自过滤膜获得过滤膜截面；
[0031]工序c)，利用对蛋白质的聚集体具有特异性的至少一种染色剂，在工序a)之前对含蛋白质的溶液进行处理，或在工序b)之前对过滤膜进行处理，或在工序b)之后对过滤膜截面进行处理；和
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种评价含蛋白质的溶液的过滤膜的堵塞的方法，其包括下述工序：工序a)，使含蛋白质的溶液通过过滤膜；工序b)，在所述工序a)之后，自所述过滤膜获得过滤膜截面；工序c)，利用对所述蛋白质的聚集体具有特异性的至少一种染色剂，在所述工序a)之前对所述含蛋白质的溶液进行处理，或在所述工序b)之前对所述过滤膜进行处理，或在所述工序b)之后对所述过滤膜截面进行处理；和工序d)，确认所述过滤膜截面中的所述蛋白质的聚集体的存在。2.根据权利要求1所述的方法，其在所述工序a)之后还包括将所述过滤膜洗涤的工序。3.根据权利要求1或2所述的方法，其在所述工序c)之后还包括将所述过滤膜洗涤的工序。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其还包括向所述过滤膜添加将没有聚集的所述蛋白质和聚集的所述蛋白质这两者染色的染色剂的工序。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其还包括将所述过滤膜截面固定的工序。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述过滤膜截面为所述过滤膜的切出的切片的截面。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，对所述聚集体具有特异性的染色剂含有与所述蛋白质的聚集体的聚集部特异性地结合而发出荧光的物质。8.根据权利要求7所述的方法，其中，对所述聚集体具有特异性的染色剂为选自尼罗红、硫磺素T、PROTEOSTAT和它们的衍生物中的至少一种。9.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，对所述聚集体具有特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：岩崎琢磨，小栗良太，
申请(专利权)人：旭化成医疗株式会社，
类型：发明
国别省市：